大麥種質(zhì)資源成株期對西藏白粉菌自然群體的抗性評價及8 個菌株的毒性譜分析

王延宇，王鳳濤，郎曉威，馮 晶，旺 姆*，藺瑞明*

（1.西藏農(nóng)牧學院植物科學學院，西藏林芝860000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193）

根據(jù)種子是否帶稃，大麥（Hordeum vulgareL.）分為有稃型皮大麥和無稃型裸大麥[1]，它是世界第四大禾谷類作物[2]，也是我國第四大禾谷類作物，主要用于飼料、釀造業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)原料和保健食品，少部分作為糧食。在青藏高原及其周邊地區(qū)，裸大麥（H.vulgareL.var.nudum）也被稱作青稞，它是該區(qū)域內(nèi)唯一廣泛栽培的主要糧食作物和重要飼草來源[3]。大麥栽培區(qū)域廣泛分布于全球溫帶地區(qū)，因而其病害種類多，主要病害有80 多種[1]，造成大麥平均減產(chǎn)15.0%～38.5%，其中白粉病是最重要的葉部病害之一，在世界各大麥種植區(qū)域均有分布，平均造成的產(chǎn)量損失為1%～14%[4]。大麥白粉病是由禾谷布氏白粉菌大麥專化型（B. graminisf. sp.hordei）引起的氣傳真菌病害，病原菌能在大麥整個生育期的任何階段侵染寄主植物地上部分的各個部位。白粉病主要發(fā)生在潮濕、半潮濕地區(qū)，感染白粉病的葉表面被菌絲覆蓋，嚴重影響了作物葉片的光合作用和蒸騰作用；另外，感病大麥葉片合成的養(yǎng)分流向被侵染部位，造成全株營養(yǎng)不良[1]。在英國，白粉病造成大麥減產(chǎn)6%～14%，但在美國平均產(chǎn)量損失不到1%，這主要與主栽品種的抗性水平和病原菌的毒性變異有關(guān)[4]。因此，在白粉病流行年份，品種抗病水平是決定產(chǎn)量損失的關(guān)鍵因素。大麥對白粉病的抗性主要由主效和微效抗病基因所控制[5-7]。目前已經(jīng)標記定位了100 多個大麥抗白粉病基因，其中一些抗病基因如mlo具有持久廣譜的抗病特點，已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛利用[7]。大麥不同染色體上分布了22 個主效抗病基因位點，其中Mla、Mlra、Mlat、Mli、MRu2、Mlk、Mlnn、MlGa和Mlp定 位在1H 染色體上，MlLa和Mlhb定位在2H 染色體上，Mlg和MlBo定位在4H 染色體上，Mlj和Mlh定位在5H 染色體上，mlt和Mlf定位在7H 染色體上[7]。野生型感病Mlo基因通過突變產(chǎn)生一系列mlo隱性等位抗病基因。已獲得30 個Mlo突變等位基因[8]，其中只有mlo-11為自然突變基因，其余均為人工誘導(dǎo)突變。通過自然突變和有性雜交，病原菌B.graminisf.sp.hordeide群體中存在非常豐富的毒性變異，新致病類型不斷出現(xiàn)[9]。由于大麥白粉病抗源基因大規(guī)模多年單一化利用，加快了病原菌群體毒性變異速度，導(dǎo)致主栽品種中廣泛利用的具有小種?；缘目共』颉皢适А笨剐远?yōu)楦胁10]，縮短了優(yōu)良品種在生產(chǎn)上的使用周期，給抗病新品種選育造成極大的壓力。因而，發(fā)掘和利用抗病譜寬而且抗病性持久穩(wěn)定的基因尤為重要。在歐洲，大麥抗病育種中廣泛使用mlo-11基因，已經(jīng)有效控制了大麥白粉病的流行[11]。白粉病是我國東部和西南大麥主要種植區(qū)的主要葉部病害之一，特別是在浙江、江蘇和云南危害較重[7,12]。近年來，由于全球氣候變暖等因素影響，西藏自治區(qū)大麥白粉病流行區(qū)從南部林芝地區(qū)逐年向拉薩擴展，為害呈明顯加重趨勢，已發(fā)展成為西藏青稞上主要的病害[13]。

相比于化學防治措施，培育和廣泛應(yīng)用抗白粉病大麥品種具有更經(jīng)濟安全和環(huán)保的特點，尤其在我國云南、西藏等生態(tài)條件較脆弱的高海拔地區(qū)，推廣應(yīng)用抗病品種尤為迫切[13-14]。因此，需要更加合理使用和布局現(xiàn)有抗病主栽品種。同時，針對不斷出現(xiàn)的新流行小種，需要從大麥種質(zhì)資源中篩選鑒定新抗源材料。這些基礎(chǔ)性研究對大麥品種的抗病改良和合理利用具有重要意義。本研究分析了4 個來自云南和4 個來自西藏的白粉菌菌株的毒性變異情況；選用毒性譜較寬的強毒性菌株16248-4 在苗期鑒定了300 個大麥品種對白粉病抗性水平；另外，利用白粉病常發(fā)流行區(qū)病原菌群體田間自然接種，在西藏林芝鑒定了大麥材料成株期對白粉病的抗性。篩選獲得的抗病種質(zhì)能為大麥抗白粉病育種和新抗源創(chuàng)制提供抗病基因。

表1 以大麥高感白粉病品種Pallas 為遺傳背景的抗白粉病近等基因品系

1 材料與方法

1.1 供試大麥品種（系）

用高感白粉病大麥品種花30 擴繁供試菌株，以30 個高感白粉病大麥品種Pallas 為遺傳背景的抗病近等基因品系（表1）作為分析病原菌毒性譜變異的鑒別品種，以及300 份大麥品種（系）作為待鑒定的大麥品種資源材料（表2）。

續(xù)表

表2 300 份擬進行抗白粉病鑒定的大麥品種（系）

續(xù)表

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1.2 供試大麥白粉菌株

將分離自西藏林芝地區(qū)19677、19681、19683和19688 菌株的單孢菌系和來自云南不同流行地區(qū)16248-4、16243-2、16420-1 和16204-1 菌株的單孢菌系進行毒性譜聚類分析。選用強毒性菌株16248-4 進行苗期抗病性接種鑒定；在西藏林芝地區(qū)利用流行病原菌群體以田間自然接種鑒定成株期抗病性。

1.3 大麥白粉菌毒性譜分析

1.3.1 大麥幼苗種植。將按1∶3 比例的營養(yǎng)土與地表土壤混合均勻后裝入規(guī)格為11.5 cm×11 cm×8 cm（口徑×高×底徑）的花盆中，用于播種培育高感白粉病大麥品種花30 幼苗，培養(yǎng)間溫度19～22℃，光照周期16 h（晝）/8 h（夜）。出苗7～8 d 后待第1 張葉完全展開時用于接種和擴繁白粉菌菌系。其他大麥材料的培養(yǎng)條件與花30 的相同。

1.3.2 白粉菌培養(yǎng)。用掃接涂抹的方法將活體保存的大麥白粉菌菌株接種在第1 張葉完全展開的花30 幼苗上進行擴繁，接種后套上直徑11 cm、高20 cm 的玻璃罩，玻璃罩頂部覆蓋3 層紗布，并用橡皮筋扎緊。接種后潛育培養(yǎng)的環(huán)境條件與育苗條件相同。接種7～10 d 后，花30 葉片表面形成大量菌絲和分生孢子，用于后續(xù)試驗。

1.3.3 毒性譜鑒定。利用1 套由30 個以Pallas 為遺傳背景的抗白粉病基因的近等基因品系作為鑒別品種，播種在規(guī)格為11.5 cm×11 cm×8 cm（口徑×高×底徑）的花盆中，每盆穴播5 個品種（系），按照逆時針方向順序點播，每穴播種1 個品種（系），每個品種（系）播7～8 粒種子，并插牌標注每一盆的起始品種（系）序號，用漏網(wǎng)過濾的細土覆蓋種子。然后將播種好種子的種植盆放入事先加好水的托盤中進行滲水處理。最后將充分吸水的花盆放在19～22℃溫室中光照培養(yǎng)7～8 d，待第1 張葉完全展開后用掃接涂抹的方法將花30 擴繁的8 個菌株的單孢菌系接種到鑒別品系上進行毒性譜分析。接種后幼苗在溫度16～18℃、光照周期16 h（晝）/8 h（夜）條件下潛育培養(yǎng)8 d，待感病對照品種花30 充分發(fā)病，接種葉片白粉病嚴重度達到80%～100%，按照0～4級標準調(diào)查第2 張葉片的侵染型，每個鑒別品系調(diào)查5～8 株。

1.3.4 毒性譜聚類分析。根據(jù)單孢菌系在每個鑒別品系上的侵染型計算其平均值，同時按照公式（毒性頻率= 感病鑒別品系個數(shù)/ 鑒別品系總數(shù)×100%）統(tǒng)計各菌系的毒性頻率。平均侵染型0～2 級為抗病反應(yīng)，3～4 級為感病反應(yīng)。將抗病類型記為‘0’，感病類型記為‘1’。將表1 轉(zhuǎn)化為單孢菌系侵染型組成的二進制矩陣，用群體遺傳結(jié)構(gòu)分析軟件PopGene32 對二進制矩陣進行分析，計算出來自不同地點的大麥白粉菌群體的毒性距離和毒性一致度，最后運用群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析軟件NTsys 對結(jié)果進行聚類分析。

1.4 大麥品種抗白粉病鑒定

1.4.1 苗期抗白粉病鑒定。1）麥苗培養(yǎng)。鑒定材料的播種方法和培養(yǎng)條件與近等基因系的相同。播種后在19～22℃溫室中光照培養(yǎng)7～8 d 后，待第1張葉完全展開即可用于抗大麥白粉病的接種鑒定試驗。2）接種方法。采用掃接的方法，用提前在感病品種花30 上擴繁好的強毒性菌株16248-4 分生孢子的大麥葉片輕輕掃抹待鑒定的大麥品種幼苗。接菌后，用直徑10 cm 的玻璃罩套在種植盆上，并用紗布對罩子進行封口。將接菌后的材料轉(zhuǎn)移至18℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)，光照周期16 h（晝）/8 h（夜）。3）調(diào)查方法。苗期抗病性鑒定是以品種Pallas 作感病對照品種。接種約10 d 后，待Pallas 發(fā)病完全，嚴重度達到80%～100%，對待鑒定材料進行侵染型調(diào)查并記錄，每個品種調(diào)查6～8 株。

1.4.2 成株期抗性鑒定。1）大麥種植。選取西藏自治區(qū)林芝市西藏農(nóng)牧學院歷年大麥白粉病發(fā)病最嚴重的地塊，行播311 個供試大麥品種，每行長2 m，每行1 個品種，播撒20～30 粒種子，每10 行種植1 行高感大麥白粉病品種花30，根據(jù)當?shù)靥镩g管理要求進行除草澆水等日常管理。最后僅獲得300份材料的調(diào)查數(shù)據(jù)（表2）。2）接種方法。西藏林芝市及周邊地區(qū)是重要的青稞白粉病流行區(qū)，利用自然菌源接種感病誘發(fā)型品種花30 和待鑒定品種。3）調(diào)查方法。成株期抗性鑒定以品種花30 為感病對照，在大麥至灌漿后期感病對照發(fā)病完全（侵染型＞3 型）時，依據(jù)國家行業(yè)標準《大麥品種抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第2 部分：抗白粉病》（NY/T 3060.2—2016），對待鑒定的大麥材料進行成株期白粉病侵染型分級鑒定，侵染型分級和抗性評價標準與苗期抗性鑒定相同，也采用0～4 級分級標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉菌毒性譜鑒定

利用30 個鑒別品種對8 個白粉菌菌株的毒性譜進行分析，結(jié)果表明，毒性頻率介于13.3%～36.7%（表3），其中：4 個分離自西藏林芝地區(qū)的菌株19677、19681、19683 和19688，毒性頻率為13.3%～20.0%；而其他4 個來源于云南的菌株毒性頻率為23.3%～36.7%，說明其毒性譜范圍明顯較來自西藏林芝地區(qū)菌株的毒性譜寬。從中還發(fā)現(xiàn)部分抗病基因或基因組合如[Mla1,Mla(Al2)]、Mla22、Ml(Ru2)、Mlnn、MlLa、Mlh和MlLa已‘喪失’抗病功能，不能繼續(xù)利用。對來自于云南和西藏地區(qū)的8 個菌株毒性譜進行聚類分析，比較2 個地區(qū)間白粉病菌群體致病表型之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)云南的3 個菌株16248-4、16420-1 和16243-2 在相似系數(shù)0.88 時聚為一組，西藏的4 個菌株在相似系數(shù)為0.943 時聚為一組，云南菌株16204-1 在相似系數(shù)為0.905 時與西藏菌株聚在同一組，其毒性譜更類似于西藏菌株（圖1）。因此，我國西南地區(qū)的2 個大麥白粉病主要流行區(qū)西藏林芝和云南的大麥白粉病菌群體的毒性譜存在較大的差異，但不排除兩地白粉菌群體之間也存在著交流。

表3 大麥白粉病菌8 個菌株對抗白粉病近等基因系鑒別品系的毒性譜分析

續(xù)表

圖1 大麥白粉菌8 個菌株的毒性譜聚類分析

2.2 大麥品種（系）抗白粉病鑒定

利用毒性譜比較寬的菌株16248-4 苗期接種鑒定300 個大麥品種（系）抗白粉病水平。其中103個品種（系）表現(xiàn)為高抗類型（侵染型為0～1+），28個品種（系）表現(xiàn)為中抗類型（侵染型2-～2+），146個品種（系）表現(xiàn)為中感類型（侵染型為3-～3+），23個品種（系）表現(xiàn)為高感類型（侵染型4）。在西藏林芝利用白粉菌自然菌源進行成株期抗病鑒定，發(fā)現(xiàn)其中153 個品種（系）為高抗類型，63 個品種（系）表現(xiàn)為中抗類型，82 個品種（系）為中感類型，2 個品種（系）為感病類型。

結(jié)合苗期和成株期抗性鑒定結(jié)果（表4、圖2），在所鑒定分析的300 份材料中，92 個大麥品種（系）如法引一號、法引二號和貝菜勤斯等在苗期與成株期均表現(xiàn)為高抗白粉病，9 個大麥品種（系）如莆大麥9 號、昆侖15 號和保大麥14-J5 等在苗期與成株期均為中抗材料，上述101 個大麥品種（系）具有全生育期抗性特點；12 個品種（系）如駐大麥6 號、揚飼麥1 號和揚農(nóng)啤9 號等在苗期表現(xiàn)為抗病類型，但在成株期表現(xiàn)為感病反應(yīng)；97 個品種（系）如蒙古國草麥、西引2 號和青裸喜馬拉19 號等在苗期表現(xiàn)為感病類型，但在成株期卻表現(xiàn)為抗病，具有成株抗性特點；另外，還有72 個品種（系）在苗期和成株期均為感病類型。

表4 大麥品種（系）資源苗期和成株期白粉病侵染型與抗性表型評價

續(xù)表

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圖2 大麥品種（系）苗期和成株期抗白粉病類型鑒定

3 結(jié)論與討論

大麥白粉病是我國大麥生產(chǎn)上的重要氣傳病害之一，在冬大麥區(qū)包括浙江、江蘇、湖北、安徽、福建和春大麥區(qū)云南及西藏能造成嚴重的經(jīng)濟損失[7,12]。特別是在云南、福建和浙江，白粉病為害尤為嚴重。近年來，由于受全球氣候變暖的影響，我國白粉病發(fā)生為害情況和主要流行分布區(qū)域發(fā)生了明顯變化，尤其是在青稞主產(chǎn)區(qū)西藏白粉病為害日益加重，流行區(qū)域從南部林芝地區(qū)向北逐步擴展蔓延。目前，拉薩河流域也是白粉病的常發(fā)流行區(qū)，西藏多數(shù)青稞栽培區(qū)域均發(fā)生白粉病。類似小麥白粉病，大麥白粉病病原菌可以通過氣流遠距離傳播，病原菌群體間跨地區(qū)交流頻繁[15]。云南是我國西南地區(qū)大麥白粉病的主要菌源地，自然條件下普遍存在有性生殖，因而病原菌群體毒性變異頻率高，群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但在西藏林芝地區(qū)自然條件下極少發(fā)生白粉菌有性雜交并形成子囊殼。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，云南菌株的毒性頻率比來自西藏林芝地區(qū)的菌株的毒性頻率高，毒性譜更寬。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)不僅與環(huán)境條件有關(guān)，寄主抗性的選擇壓力也是促進病原菌毒性變異的重要原因。因白粉病的持續(xù)嚴重為害，云南皮大麥和裸大麥（即青稞）抗病育種中更重視將抗病基因引入育種體系，從而加大了對病原菌群體的抗性選擇壓力，促進病原菌毒性變異。同時筆者發(fā)現(xiàn)，西藏和云南白粉菌群體并沒有完全隔離，2 個群體之間存在一定程度的交流。目前，還缺乏證據(jù)表明林芝是我國西南地區(qū)另一個大麥白粉菌菌源地。已經(jīng)鑒定出100 多個大麥抗白粉病基因，但大多數(shù)抗病基因由于病原菌流行優(yōu)勢小種更替而“喪失”抗病功能，仍在利用的如mlo等抗病性持久穩(wěn)定的基因較少[16]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)部分抗病基因已經(jīng)“喪失”對鑒定的8 個菌株的抗病功能，在生產(chǎn)上不能繼續(xù)使用這些基因。

相比其他氣傳真菌病害，白粉菌群體毒性變異頻率更高，致病類型更豐富，因而抗病基因有效使用壽命更短。因此，不斷篩選和發(fā)掘抗病基因尤為重要和迫切，也是培育抗病大麥新品種的前提和基礎(chǔ)。大麥在我國長江流域中部地區(qū)、東部地區(qū)和西南地區(qū)具有悠久的栽培歷史，這些區(qū)域也是白粉病主要流行區(qū)域，因而在我國大麥資源中也存在重要的抗病遺傳資源[7]。在本研究中，利用苗期人工接種鑒定并結(jié)合成株期在病害常發(fā)區(qū)利用病原菌自然群體進行成株期抗病性鑒定，獲得92 份全生育期高抗材料和97 份具有成株抗性材料。這些材料為我國大麥白粉病抗病育種提供了重要的抗病基因資源。

白粉病是歐洲國家大麥上非常重要的葉部病害之一，因而其特別重視大麥抗白粉病基因發(fā)掘和利用[16-17]。國內(nèi)有關(guān)大麥抗白粉病工作投入相對較少，目前已從種質(zhì)資源中篩選獲得了抗病材料[18]。利用多基因聚合方法[19]，已有育種家利用有效抗白粉病基因轉(zhuǎn)育到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的主栽品種中進行抗病性遺傳改良，利用大麥白粉菌自然菌源對回交后代株系進行抗病性選擇。大麥抗病基因的選擇壓力、病原菌長距離傳播和有性重組是促進白粉菌群體毒性結(jié)構(gòu)改變和遺傳進化的主要因素[20]。因此，更應(yīng)積極挖掘新抗源，改良大麥品種抗病性，及時淘汰感病品種，合理布局抗病品種。這也有利于穩(wěn)定大麥白粉菌群體的毒性結(jié)構(gòu)，降低新流行小種的出現(xiàn)頻率。