血清microRNA-200c在原發(fā)性腎病綜合征中的表達(dá)及臨床意義分析

萬(wàn) 菁 白 微 陳 紅 奚經(jīng)巧 郭躍麗

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrtic syndrome，PNS）是臨床常見(jiàn)的一組腎臟疾病綜合征。腎病綜合征已成為臨床上最常見(jiàn)的腎小球疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。目前，原發(fā)性腎病綜合征的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)主要依靠血和尿生化檢測(cè)（如尿蛋白、血人血白蛋白、血脂水平和尿量等）和創(chuàng)傷性檢查（如腎臟穿刺活檢）。然而，尚缺乏理想的生物標(biāo)志物用于原發(fā)性腎病綜合征的診斷和用于激素治療效果和預(yù)后預(yù)測(cè)[3]。近年來(lái)，miRNA（MicroRNA）作為疾病的新分子標(biāo)志物得到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，然而，microRNA在腎病綜合征的應(yīng)用研究仍處于起步階段[4-5]。因此，本研究擬探索原發(fā)性腎病綜合征患者血清microRNA-200c的表達(dá)水平變化情況，并探討其臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象：采用嚴(yán)格篩選、遵循自愿原則，選取在本院首診并診斷為原發(fā)性腎病綜合征的160例患者作為病例組研究對(duì)象；同時(shí)，按照1∶1 匹配的方法另選取160名同期健康體檢人員為對(duì)照組，對(duì)照組匹配的主要要求：年齡相差＜2歲、性別一致、民族一樣、經(jīng)濟(jì)收入相當(dāng)、職業(yè)相當(dāng)、居住條件相當(dāng)。

1.2 資料收集方法：收集所有患者和對(duì)照組的病史，檢測(cè)患者和對(duì)照組血液和尿液標(biāo)本，檢測(cè)他們的血常規(guī)、尿常規(guī)和血液相關(guān)生化指標(biāo)。所有研究方案均通過(guò)溫州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照Helsinki國(guó)際宣言，在原發(fā)性腎病綜合征研究中，告知參與者本研究的內(nèi)容及意義，在完全志愿的基礎(chǔ)上簽署知情同意書后收集。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的《內(nèi)科學(xué)》中關(guān)于原發(fā)性腎病綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)：大量蛋白尿，24 h尿蛋白含量超過(guò)3.5 g/L，血漿白蛋白＜30 g/L，膽固醇＞5.7 mmol/L，并且伴有不同程度水腫。

1.4 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：所有入選患者均經(jīng)臨床確診，并符合原發(fā)性腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)，近期內(nèi)未服用激素等藥物進(jìn)行治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除繼發(fā)性腎病綜合征患者，排除合并心臟病、腫瘤以及嚴(yán)重肝功能異常者以及有精神類和神經(jīng)病史患者。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)：所有患者的血清和尿液樣本均在首診后未接受治療前采集，處理過(guò)程嚴(yán)格按照如下步驟進(jìn)行：收集原發(fā)性腎病綜合征患者和正常對(duì)照的全血及尿液樣本。收集的血清和尿液樣本在室溫下3000 g離心10 min去除細(xì)胞并收集上清，然后將收集的上清在4 ℃條件下，12000 g離心5 min，進(jìn)一步去除殘留的細(xì)胞，離心后收集上清置于干凈的Eppendoff管中-80 ℃保存待用。另外，所有研究對(duì)象測(cè)定血尿常規(guī)、血漿總蛋白、白蛋白、血肌酐、尿素氮和血漿膽固醇和三酰甘油及24 h尿蛋白定量和病理亞型等指標(biāo)。

1.6 試劑：Trizol試劑（美國(guó)Invitmgen），miRNeasy mini kit（美國(guó)QIAGEN公司）；miRNA-200c及U6引物試劑盒（上海生工）。

1.7 血清RNA提?。撼叵陆鈨鰳颖荆⊙鍢颖?00 μL血清按Trizol試劑和miRNeasy mini kit說(shuō)明書提取總RNA。外光分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）進(jìn)行血漿總RNA濃度和純度的鑒定，變性凝膠電泳法檢測(cè)RNA完整性，放入-80 ℃低溫冰箱留存待用。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)血清miRNA-200c表達(dá)水平：使用miScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR試劑盒，以U6為RNA內(nèi)參進(jìn)行qPCR檢測(cè)血清miRNA-200c表達(dá)水平，反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書設(shè)置。miRNA-200c：5’-GCGCTAATACTGCCGGGTAATGAT-3’，77bp；U6：5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，94 bp。miRNA-200c相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述用±s表示，兩組均數(shù)的比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，定性資料的描述采用率或構(gòu)成比，組間的率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)；運(yùn)用Pearson或者秩相關(guān)性檢驗(yàn)分析腎病綜合征患者血清中miRNA-200c表達(dá)水平與臨床檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性；采用多多元Logistics回歸分析腎病綜合征的主要影響因素。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群一般情況比較：入組本研究的病例組和對(duì)照組分別由160例，均為72例男性人和88例女性。其中，病例組平均年齡（36.37±6.28）歲（18～68歲），對(duì)照組平均年齡（36.26±7.01）歲（18～69歲），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組人群的生活行為和臨床指標(biāo)對(duì)比：病例組和對(duì)照組的飲酒率、糖尿病史、空腹血糖、高密度脂蛋白（HDL）等指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而病例組患者的吸煙率、BMI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和β2-MG均高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 病例組和對(duì)照組之間相關(guān)行為和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果對(duì)比（±s）

表1 病例組和對(duì)照組之間相關(guān)行為和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果對(duì)比（±s）

2.2 兩組人群血清microRNA-200c的表達(dá)水平分析：運(yùn)用qPCR技術(shù)，檢測(cè)了腎病綜合征患者和健康對(duì)照組血清microRNA-200c的表達(dá)水平，結(jié)果顯示病例組的血清microRNA-200c的表達(dá)水平為（6.869±0.768），明顯高于對(duì)照組血清microRNA-200c的表達(dá)水平（1.138±0.151），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 microRNA-200c與腎病綜合征患者相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析：采用相關(guān)分析探索microRNA-200c與腎病綜合征患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示患者血清中microRNA-200c的表達(dá)與BMI、TC、TG、LDL及β2-MG呈正相關(guān)，與其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.4 腎病綜合征影響因素的多元Logistics回歸分析：在單因素logistic回歸分析基礎(chǔ)上，引入單因素分析有顯著性意義的因素，作多因素Logistic回歸分析，采用Backward：LR法，建立回歸模型，篩選出5個(gè)影響因素最終進(jìn)入回歸方程，顯示BMI（OR=1.994）、TC（OR=3.061）、LDL（OR=3.551）、β2-MG（OR=2.231）、microRNA-200c（OR=8.147）是腎病綜合征的主要危險(xiǎn)因素，其中microRNA-200c與腎病綜合征的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最大，見(jiàn)表3。

表2 血清中microRNA-200c與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

表3 腎病綜合征影響因素的多元Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

原發(fā)性腎病綜合征是臨床上常見(jiàn)的腎小球疾病。近年來(lái)，本病的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)[6]。目前，對(duì)于腎病綜合征的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，若不及時(shí)給予有效治療，可能引發(fā)腎小管損傷、急性腎功能不全等并發(fā)癥，嚴(yán)重者可發(fā)展為慢性腎衰竭[7-8]。腎病綜合征早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)往往已發(fā)展至終末期腎病。因此，探尋可靠、穩(wěn)定和準(zhǔn)確的方法來(lái)早期診斷本疾病，對(duì)及早采取正確的治療方法進(jìn)行早期干預(yù)具有重要的臨床意義。

miRNA（MicroRNA）是一類長(zhǎng)21～25 nt的單鏈小分子RNA，一般來(lái)源于染色體的非編碼區(qū)，具有高度保守性。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在很多疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控功能[9-10]。miR-200c是miR-200家族成員之一，其定位于染色體12p13.31[11]。miR-200c在腫瘤方面的研究較多，它在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，具有極強(qiáng)的抑癌基因活性，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖：侵襲、轉(zhuǎn)移及化療藥物敏感性密切相關(guān)[12]。然而，microRNA-200c在腎病綜合征角色的研究甚少。wang等[13]對(duì)尿液miRNAs進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者尿miR-200a，miR-200b和miR-429水平下降。尿部分miRNA下降明顯的患者其蛋白尿水平較高，基線腎功能較差。隨訪（33.4±12.6）個(gè)月后，基礎(chǔ)尿miR-200b（r=0.316，P=0.034）較低患者其腎功能減退亦較明顯，提示這些尿miRNA片段對(duì)于原發(fā)性腎病綜合征的臨床表現(xiàn)及預(yù)后相關(guān)。他還發(fā)現(xiàn)，尿miR-29a，miR-192和miR-200c可能是診斷腎病綜合征和判斷疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[14]。然而，miR-200c與原發(fā)性腎病綜合征的相關(guān)臨床指標(biāo)關(guān)系如何，它與原發(fā)性腎病綜合征發(fā)生發(fā)展的關(guān)系如何仍未被闡明。

本研究選取在首診并診斷為原發(fā)性腎病綜合征的160患者作為病例組研究對(duì)象，按照1∶1 匹配的方法另選取160同期健康體檢人員為對(duì)照組。收集他們的臨床信息和血液樣本，檢測(cè)他們的血生化指標(biāo)，并采用定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組人群血清microRNA-200c表達(dá)水平，分析其臨床意義。結(jié)果顯示原發(fā)性腎病綜合征患者血清中microRNA-200c的表達(dá)水平上調(diào)，它的表達(dá)與腎功能損傷和血脂指標(biāo)具有相關(guān)性。腎病綜合征患者中，腎功能損傷指標(biāo)和血脂指標(biāo)是反應(yīng)病情變化的重要指標(biāo)，而本研究發(fā)現(xiàn)這兩類指標(biāo)與microRNA-200c的表達(dá)相關(guān)性明顯，提示microRNA-200c可能與腎病綜合征的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。

本研究采用多元回歸分析方法，發(fā)現(xiàn)BMI、TC、LDL、β2-MG、microRNA-200c是腎病綜合征的主要危險(xiǎn)因素，其中microRNA-200c與腎病綜合征的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最大，它是腎病綜合征發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示microRNA-200c可能是腎病綜合征潛在的新分子標(biāo)志物。當(dāng)然，本研究只是橫斷面研究方法探索microRNA-200c在腎病綜合征中的角色，它對(duì)腎病綜合征的診斷價(jià)值和預(yù)后預(yù)測(cè)能力，有待后續(xù)深入研究。