正交試驗優(yōu)選黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的提取工藝

劉 艷 張 慧 熊然英 楊朝蓮

貴州省六盤水市食品藥品檢驗檢測所，貴州 六盤水 553001

錦雞兒又名陽雀花，為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒Caraganasinica(Buc’hoz.)Rehd.的干燥根[1]，分布于河北、新疆、山東、江蘇、浙江、江西、福建、河南、湖南、四川、云南和貴州等地，具補肺健脾、活血祛風的功效，主治高血壓、虛勞倦怠、肺虛久咳、婦女血崩、白帶、乳少、風濕骨痛、痛風、半身不遂、跌打損傷[2]。民間藥用錦雞兒屬植物主要有錦雞兒、中間錦雞兒、藏錦雞兒等。貴州藥用錦雞兒屬植物為錦雞兒，主要含有黃酮、二苯乙烯、萜類、甾體等成分[3-5]，其中黃酮類成分有抗菌、抗氧化[6]等活性。因此本研究以錦雞兒總黃酮為質(zhì)量控制指標，測定黔產(chǎn)錦雞兒藥材中總黃酮含量。目前文獻報道錦雞兒屬黃酮的研究主要為施蛟等對中間錦雞兒黃酮類成分的化學(xué)研究、鄭敏燕等對藏錦雞兒總黃酮含量的初步研究及樸惠順等對小葉錦雞兒與朝鮮錦雞兒總黃酮含量的比較研究[7-9]，尚未對黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮進行研究，為了更好地發(fā)展貴州民族藥，開發(fā)利用黔產(chǎn)錦雞兒，本實驗通過正交試驗，采用紫外分光光度法進一步研究黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取方法，為黔產(chǎn)錦雞兒的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材 采自貴州省六盤水市、安順市、興義市、畢節(jié)市、貴陽市、銅仁、凱里、都勻、遵義、威寧等地，經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學(xué)周漢華副教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒Caraganasinica(Buc’hoz)Rehd.的干燥根。

1.2 試藥與試劑 蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：10080-201610，UV含量92.6%)。試劑均為分析純，實驗用水均為自制二級純凈水。

1.3 儀器 Thermo Evolution 220紫外分光光度計(賽默飛(上海)儀器有限公司)，ME104E萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，AG135十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，HH恒溫水浴鍋(江蘇中大儀器科技有限公司)，SB-5200DTDN超聲波提取器(寧波新芝生物科技有限公司)，DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品約20 mg，精密稱定，置 100 mL量瓶中，加乙醇適量，振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含無水蘆丁0.2 mg)。

2.2 最大吸收波長的確定 取蘆丁對照品溶液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，按紫外-可見分光光度法《中國藥典》2015年版四部 (通則0401)，于400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果蘆丁對照品溶液在509.98 nm處有最大吸收，故選510 nm為測定波長。吸收光譜如圖1所示。

2.3 標準曲線的制備 精密量取蘆丁對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL容量瓶中，按2.2項下自“加水至6 mL”起，同法操作，分別在510 nm處測定其吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，對照品濃度(mg/mL)(X)為橫坐標，計算回歸方程得：Y=13.375X-0.0055，r=0.9998。在0.00865～ 0.05189 mg/mL范圍內(nèi)，線性良好。蘆丁標準曲線如圖2所示。

2.4 正交試驗優(yōu)選提取方法 根據(jù)初步試驗的結(jié)果，乙醇作為提取溶劑，回流提取作為提取方法，選用L9(34)正交試驗表，以直接影響總黃酮收率的提取倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)為試驗因素，每個因素3個水平，見表1；對黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取方法進行優(yōu)選，見表2、表3。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗直觀分析表

表3 正交實驗方差分析表

由方差分析，該實驗因素對實驗結(jié)果無顯著性。所以由直觀分析應(yīng)選擇A2B2C3實驗方案，即是料液比1∶100倍(50 mL)，回流提取3次，每次60 min。

2.5 驗證試驗 按照A2B2C3的條件提取3次，進行吸光度測定，其總黃酮含量的平均值為2.83%，RSD為1.18%。由實驗結(jié)果看出，利用正交實驗方法確定的A2B2C3為最佳提取工藝。

2.6 供試品溶液的制備 黔產(chǎn)錦雞兒藥材粉碎過篩，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱重，水浴回流提取3次，每次60 min，放冷，用乙醇補足減失的重量，濾過，合并續(xù)濾液備用。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2項下自“加水至6 mL”起，按實驗方法操作連續(xù)測定6次吸光度，結(jié)果為0.324、0.314、0.324、0.329、0.322、0.325，平均值為0.323，RSD為1.54%。表明精密良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2項下自“加水至6 mL”起，同法操作，在顯色后0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min在510 nm處測定，其吸光度分別為0.392、0.398、0.403、0.404、0.404、0.405、0.404、0.404、0.403、0.402，平均值為0.402，RSD為0.99%，表明黔產(chǎn)錦雞兒供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3 重復(fù)性試驗 黔產(chǎn)錦雞兒供試品溶液6份，分別取3 mL置25 mL的容量瓶中，按2.2項下自“加水至6 mL”起，同法操作，顯色后在510 nm處測定，其吸光度分別為0.364、0.365、0.364、0.371、0.379、0.375，平均值為0.370，RSD為1.73%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.7.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的黔產(chǎn)錦雞兒樣品6份，每份約0.25 g，分別精密加入蘆丁對照品6 mg，進行含量測定并計算回收率，結(jié)果蘆丁的平均回收率為99.50%(n=6)，RSD=1.88%。見表4。

表4 加樣回收率試驗實驗結(jié)果

2.8 黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮含量測定 10批黔產(chǎn)錦雞兒樣品按最佳提取條件提取，分別精密量取3 mL置25 mL的容量瓶中，再按2.2項下自“加水至6 mL”起，同法操作，在510 nm處測定吸光度，并計算黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的含量。結(jié)果見表5。

表5 黔產(chǎn)錦雞兒藥材總黃酮含量測定實驗結(jié)果

3 討論

從以上實驗結(jié)果可知，用分光光度法測定黔產(chǎn)錦雞兒中總黃酮含量簡便、快速、準確，可作為黔產(chǎn)錦雞兒中總黃酮含量的一種方法。

正交試驗中通過極差分析得到：極差C>極差A(yù)>極差B，因此比較得到影響總黃酮提取因素的主次為提取次數(shù)>提取倍數(shù)>提取時間。結(jié)果表明，黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取條件為：選用乙醇作為溶劑，料液比1∶100倍，回流提取3次，每次60 min ，合并濾液。該工藝合理，可作為黔產(chǎn)錦雞兒藥材中總黃酮的提取方法。

文獻報道藏錦雞兒中總黃酮平均含量為1.64%，小葉錦雞兒與朝鮮錦雞兒總黃酮含量均小于1%，安徽產(chǎn)錦雞兒總黃酮平均含量為3.37%，本實驗測得黔產(chǎn)錦雞兒材總黃酮的平均含量為2.57%，說明錦雞兒屬植物不同種之間總黃酮含量不同，不同產(chǎn)地間錦雞兒的質(zhì)量存在一定差異，不同地理環(huán)境，生態(tài)條件對錦雞兒藥材質(zhì)量有一定影響。本實驗可以為黔產(chǎn)錦雞兒的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。