五味子乙素對(duì)心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞及線粒體損傷的影響

武衛(wèi)黨，張丹鳳，郭紀(jì)文，徐曉輝，路 艷，陳文璐，耿蓬勃

心肌缺血/再灌注造成的損傷是目前臨床限制冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈搭橋和冠狀動(dòng)脈溶栓等治療手段有效開(kāi)展的關(guān)鍵問(wèn)題，且可能導(dǎo)致心肌缺血/再灌注性二次損傷，嚴(yán)重限制上述手術(shù)治療手段的廣泛運(yùn)用，給病人健康帶來(lái)了極大風(fēng)險(xiǎn)[1]。五味子乙素是在中藥北五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素。北五味子屬于收斂固澀藥，具有益氣生津、寧心安神功效，使其廣泛存在于補(bǔ)益類的方劑之中，同時(shí)具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性，酸、咸入肝而補(bǔ)腎，辛、苦入心而補(bǔ)肺，甘入中宮益脾胃，常用于治療肝臟疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，北五味子乙素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少氧自由基釋放、保護(hù)缺血心肌免受缺血再灌注損傷有關(guān)，北五味子乙素對(duì)大鼠離體心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，通過(guò)誘導(dǎo)自噬改善缺血再灌注損傷發(fā)生[2-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞蛋白合成的主要場(chǎng)所，在缺氧、氧化應(yīng)激等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊的蛋白質(zhì)明顯增多，當(dāng)超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力，細(xì)胞激活相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊環(huán)境，但持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生可誘導(dǎo)下游分子激活，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，也導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響線粒體功能。線粒體是細(xì)胞能量發(fā)生器，線粒體功能異常進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5-6]。本研究將通過(guò)建立大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激動(dòng)劑誘發(fā)的大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，探討五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致線粒體損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器 五味子乙素、毒胡蘿卜素內(nèi)脂購(gòu)自Sigma公司。H9c2大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自GIBCO公司；ATP檢測(cè)試劑盒、線粒體提取試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)，線粒體呼吸鏈復(fù)合酶試劑盒(南京建成生物工程公司)；細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(Santa，美國(guó))。主要儀器Heracell 240i型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermofisher公司，美國(guó))；BCM-1000生物潔凈工作臺(tái)(青島聚創(chuàng)美家環(huán)保技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)。

1.2 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株培養(yǎng) H9c2大鼠心肌細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，D-hanks液漂洗后加入含1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。不做缺氧/復(fù)氧處理，即為正常組。

1.3 H9c2缺氧/復(fù)氧模型及毒胡蘿卜素內(nèi)脂誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型建立

1.3.1 缺氧/復(fù)氧模型 將H9c2心肌細(xì)胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10%FBS的DMEM培養(yǎng)液更換為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液，在缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱充入95%N210 min后，將缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧4 h，之后去掉PBS緩沖液，重新加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃，20%O2，5%CO2中培養(yǎng)12 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)即為模型組。五味子乙素干預(yù)組分別于缺氧4 h模型建立后，給予五味子乙素低劑量、中劑量、高劑量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干預(yù)12 h檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 毒胡蘿卜素內(nèi)脂誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型 將H9c2心肌細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入40 nmol/L毒胡蘿卜素內(nèi)脂24 h，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。五味子乙素干預(yù)組分別于毒胡蘿卜素內(nèi)脂加入后，給予五味子乙素低劑量、中劑量、高劑量(5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L)干預(yù)24 h檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法檢測(cè)H9c2細(xì)胞存活率 將H9c2心肌細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，缺氧細(xì)胞4 h后分別加入不同濃度五味子乙素(分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后，用于MTT檢測(cè)；H9c2心肌細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，分別加入不同濃度五味子乙素(分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)及30 nmol/L毒胡蘿卜素內(nèi)脂24 h后，用于MTT檢測(cè)。檢測(cè)細(xì)胞每孔中加入5 g/L的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩10 min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量檢測(cè) 采用南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所購(gòu)買(mǎi)的SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，檢測(cè)兩種模型心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px活性、MDA含量。

1.6 分離提取線粒體、細(xì)胞質(zhì) 按照試劑盒方法，用細(xì)胞刮收集5×107個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗，4 ℃條件下，600 r/min離心5 min；棄上清液，加入1 mL線粒體提取液，并加入蛋白酶抑制劑，置于冰上孵育10 min；轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至預(yù)冷的Dounce勻漿器中，研磨。4 ℃條件下離心10 min；取上清液，4 ℃條件下，17 000 r/min離心20 min；收集上清液的細(xì)胞質(zhì)部分，將沉淀保存于線粒體儲(chǔ)存液中；BCA蛋白定量，樣品于-20 ℃保存。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 檢測(cè)心肌細(xì)胞ATP含量 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種于12孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，1 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞覆蓋板底70%后建模加藥處理。設(shè)置藥物濃度為20μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L，另設(shè)對(duì)照組。收集細(xì)胞于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入100 μL裂解液。待細(xì)胞充分裂解后，4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液用于后續(xù)測(cè)定。取新96孔板，每孔加入100 μL ATP工作液(1∶100)，室溫下放置5 min。待底物ATP消耗完畢，避光條件下每孔加入30 μL BCA法蛋白定量后樣品，2 s后立即檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次。

1.7.2 線粒體復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ活性檢測(cè) 采用紫外分光光度法測(cè)定線粒體復(fù)合物活性，操作步驟按線粒體復(fù)合物定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7.3 心臟細(xì)胞谷氨酸脫氫酶、細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9檢測(cè) 按照谷氨酸脫氫酶、細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9檢測(cè)試劑盒方法進(jìn)行，所有檢測(cè)指標(biāo)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，樣品吸光度值(A)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

2 結(jié) 果

2.1 五味子乙素對(duì)H9c2模型細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧復(fù)氧模型心肌細(xì)胞相對(duì)于正常細(xì)胞，其細(xì)胞活力顯著降低，五味子乙素可明顯增加心肌細(xì)胞活力，具有明顯的濃度依賴性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模型細(xì)胞活力顯著降低，給予五味子乙素可顯著升高細(xì)胞活力并具有濃度依賴性。詳見(jiàn)圖1。

與模型組比較，*P<0.05。

2.2 五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影響 與正常組比較，缺氧/復(fù)氧模型及毒胡蘿卜內(nèi)脂誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性均降低，MDA顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。五味子乙素具有顯著抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)作用，顯著升高SOD、GSH-Px活性，并降低MDA含量，在缺氧/復(fù)氧模型五味子乙素均具有該作用。詳見(jiàn)表1。

表1 五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、MDA水平的影響(±s)

2.3 五味子乙素對(duì)線粒體復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ活性的影響 與正常組比較，缺氧/復(fù)氧及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞兩種模型心肌細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ活性較正常細(xì)胞均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予五味子乙素后可明顯提高線粒體復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ活性，其中五味子乙素中劑量組、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 五味子乙素對(duì)線粒體復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ活性的影響(±s) 單位：mmol/(min·mg)

2.4 五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞中ATP含量的影響 兩種模型細(xì)胞線粒體能量供應(yīng)降低，ATP含量降低。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞ATP含量顯示，兩種模型心肌組織ATP含量均顯著降低(P<0.01)，給予五味子乙素后兩種模型細(xì)胞ATP含量顯著提高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 五味子乙素對(duì)不同模型細(xì)胞ATP含量的影響(±s) 單位：μmol/mg

2.5 五味子乙素對(duì)細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影響 兩種模型組相較于正常組，細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9均顯著升高，說(shuō)明線粒體損傷發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，同時(shí)激活Caspase 3、Caspase 9；給予五味子乙素后，隨著給藥劑量增加，五味子乙素可有效降低模型心肌細(xì)胞中細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 五味子乙素對(duì)細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9水平的影響(±s)

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動(dòng)脈部分或完全急性阻塞后，一定時(shí)間內(nèi)又重新獲得再通，缺血心肌雖然恢復(fù)正常灌注，但其組織損傷反而呈進(jìn)行性加重的病理過(guò)程。缺血期引起心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、心功能和電生理等一系列變化，血管再通后表現(xiàn)突出，甚至發(fā)生嚴(yán)重心律失常導(dǎo)致猝死[6]。缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞凋亡等均可能參與缺血再灌注損傷。

目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要誘因之一[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞存活和發(fā)揮細(xì)胞的正常生理功能具有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)激敏感，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激因子如缺氧、缺糖、ATP耗竭、鈣超載及蛋白降解減弱等刺激下，均引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，使未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚，統(tǒng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是機(jī)體重要的自我保護(hù)機(jī)制，但應(yīng)激反應(yīng)過(guò)強(qiáng)或應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，引起細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致組織損傷，缺血再灌注損傷時(shí)，大量自由基生成引起氧化應(yīng)激反應(yīng)等，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激，導(dǎo)致心肌組織損傷[8-10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)激活，而JNK途徑是調(diào)控線粒體功能的關(guān)鍵信號(hào)途徑，其激活引起線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，線粒體應(yīng)激反應(yīng)和線粒體膜通透性增加[11]，引起線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9等細(xì)胞因子釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[12-13]，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈正常活動(dòng)抑制，呼吸鏈復(fù)合物活性改變，線粒體ATP產(chǎn)生明顯減少，影響線粒體能量生成[14-15]，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[16]。

本研究建立缺氧/復(fù)氧H9c2心肌損傷模型及毒蘿卜素內(nèi)脂誘導(dǎo)的H9c2內(nèi)質(zhì)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)兩種模型五味子乙素對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)作用，結(jié)果表明五味子乙素可有效改善兩種模型細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，升高SOD、GSH-Px抗氧化酶活性，降低細(xì)胞MDA含量，改善脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)；通過(guò)檢測(cè)心肌組織谷氨酸脫氫酶和細(xì)胞色素C、Caspase 3、Caspase 9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素可同時(shí)減少心肌細(xì)胞谷氨酸脫氫酶和細(xì)胞色素C及Caspase 3、Caspase 9水平，對(duì)線粒體膜完整性具有明顯的保護(hù)作用。通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞ATP水平及呼吸鏈復(fù)合酶，結(jié)果表明五味子乙素線粒體能量供應(yīng)具有明顯恢復(fù)作用，可有效提高兩種模型細(xì)胞ATP含量，恢復(fù)部分線粒體復(fù)合酶活性。

綜上所述，五味子乙素對(duì)心臟缺血再灌注損傷和線粒體功能具有明顯的保護(hù)作用。