撫順地區(qū)豬鏈球菌病病原分離和鑒定

楊春艷

（撫順市農(nóng)業(yè)特產(chǎn)學(xué)校，遼寧 撫順 113123）

豬鏈球菌的血清型有35 個(gè)，還有一些菌株的血清型沒有被定型[1-2]。其中，豬鏈球菌2 型和1型，是豬的重要致病菌，可感染給人，是集約化養(yǎng)豬場(chǎng)的常見病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的細(xì)菌性傳染病[3-4]。為了檢出撫順地區(qū)豬鏈球菌病流行菌株的血清類型、耐藥性等特點(diǎn)，方便臨床更好的采取預(yù)防措施。

本研究應(yīng)用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法，在撫順地區(qū)發(fā)生豬鏈球菌病的31 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，采取典型發(fā)病豬的病料，進(jìn)行了分離培養(yǎng)、血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)、毒力測(cè)定試驗(yàn)，為該病的防治提供有力的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源

撫順地區(qū)不同豬場(chǎng)發(fā)生典型豬鏈球菌病的20頭死亡豬，在無菌條件下采取病豬心、脾、肝、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等組織樣本，共30份。

1.2 主要試劑

HM47 鏈球菌乳膠凝集標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。參考菌株ATCC35246，馬腺疫鏈球菌獸疫亞種，鏈球菌C群，2 型豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，其余菌株自行分離。070200 豬鏈球菌生化鑒定盒，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR 小鼠40 只，規(guī)格：20～25 g·只-1，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

采取病豬心，脾、肝、淋巴結(jié)30 份。進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察結(jié)果。

2.2 病原菌的分離

將病料接種在普通培養(yǎng)基上和血液平板上，37 ℃，24 h 培養(yǎng)后，挑取可疑菌落，革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢后如果看到成鏈狀排列的G+菌，將可疑菌落接種在血平板上做純培養(yǎng)后，觀察。將純培養(yǎng)的菌落接種在血清馬丁肉湯中增菌培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)。然后接種血清肉湯純化后，4 ℃冷藏備用。

2.3 生化實(shí)驗(yàn)

豬鏈球菌生化鑒定盒使用方法：從血瓊脂平板上挑取可疑的溶血性菌落，放在0.85%生理鹽水中，與0.5 McFarlang比濁管進(jìn)行比濁，將細(xì)菌懸液體制備成0.5 McFarlang，備用。再用一次性吸管吸取2滴制備好的菌懸液體，分別加入到微量生化管中，蓋上西林瓶塞子，置于瓶架上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。

2.4 血清分型

乳膠凝集實(shí)驗(yàn)過程：所有的試劑在使用前要達(dá)到室溫。用10 mL 蒸餾水把酶試劑溶解后，將酶提取液分裝于試管中，每管0.4 mL。用滅菌接種環(huán)挑取實(shí)驗(yàn)室分離的菌株加入到酶溶液中，制成菌懸液。將試管置于37 ℃水浴鍋中10～15 min，使菌液混合均勻。乳膠試劑充分搖勻，分別滴入6個(gè)反應(yīng)環(huán)內(nèi)1滴。如果存在對(duì)應(yīng)型的鏈球菌會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的顆粒凝集，為陽性。如果乳膠試劑仍然光滑，說明是陰性，無凝集或者凝集微弱。同時(shí)做AG群陽性對(duì)照、生理鹽水空白對(duì)照和ATCD35246對(duì)照。

2.5 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)

將40 只試驗(yàn)小鼠（體重20～25 g）分為試驗(yàn)組36只，共9組，每組4只，對(duì)照組4只小鼠。9株分離菌株在血清肉湯中培養(yǎng)12 h，取其培養(yǎng)物，經(jīng)過離心，吸取菌體，試驗(yàn)組每只小鼠注射0.2 mL。對(duì)照組每只小鼠腹腔注射0.2 mL 血清肉湯。注射后小鼠隔離飼養(yǎng)，記錄其發(fā)病情況。死亡小鼠立即解剖，取死亡小鼠的肝臟涂片、革蘭氏染色，鏡檢。同時(shí)要在血液瓊脂平板上做分離培養(yǎng)。

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)

將菌株在馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上接種，培養(yǎng)24 h，做含菌數(shù)為1.5×106個(gè)·mL-1的稀釋，用滅菌棉簽蘸取稀釋液在平板上均勻涂抹，蓋蓋放置5 min，用鑷子將藥敏片放在平板上輕壓實(shí)，每個(gè)平板上放3 個(gè)藥敏片，每個(gè)藥敏片距離25 mm，紙片和平板邊緣不小于15 mm，37 ℃18 h后觀察[5]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

病料經(jīng)過革蘭氏染色，陽性，病料中多為圓形或橢圓形的單個(gè)散在或成雙排列，少數(shù)是鏈狀出現(xiàn)的球菌，在血液平板上和肉湯培養(yǎng)基中的菌落，鏡檢可以看到8～15個(gè)球菌鏈。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

本細(xì)菌在有氧和無氧的條件下均能生長(zhǎng)繁殖，在普通培養(yǎng)基上不愛生長(zhǎng)。在含有葡萄糖、血液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很好，可以見到露珠樣的菌落，邊緣整齊，光滑黏稠，有α或者是β溶血環(huán)。在馬丁肉湯中，底部有沉淀。在血清肉湯中，先使肉湯混濁，后在試管底部有顆粒沉淀，無菌膜，上清液透明。

3.3 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在37 ℃條件下能夠生長(zhǎng)，在10 ℃、15 ℃條件下不能生長(zhǎng)。在40%和10%膽汁管中，呈陽性。過氧化氫酶試驗(yàn)陰性。淀粉水解試驗(yàn)（+）。甘油試驗(yàn)（-）。水解七葉苷（+）。能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等糖，能夠產(chǎn)酸。能多數(shù)發(fā)酵甘露醇等糖，少數(shù)不發(fā)酵，產(chǎn)酸，不能產(chǎn)生靛基質(zhì)。V-P 試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)（M.R）陽性。試驗(yàn)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的細(xì)菌為豬鏈球菌。

3.4 細(xì)菌血清分型結(jié)果

豬鏈球菌血清型檢驗(yàn)結(jié)果見表1。乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果：分離菌株與診斷液反應(yīng)結(jié)果為陰性，ATCD35246 與C 群診斷液反應(yīng)為陽性，A-G 群抗原對(duì)照為陽性。玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果：分離菌株與2型血清呈陽性反應(yīng)，ATCC35246 為陰性。血清試驗(yàn)結(jié)果為病料的病原屬于R群豬鏈球菌2型。

3.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

致病性試驗(yàn)結(jié)果見表2。腹腔接種分離菌株的小鼠5 h 后開始死亡，15 h 全部死亡。死后剖檢可見胸腔充滿積液，膀胱充血，肝、腎、脾水腫，心臟血液和胸腔積液涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察可見散在的或成鏈狀的G+球菌。對(duì)照組沒有任何異常。采取死亡小鼠的肝、肺等發(fā)病組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，分離菌株的培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)結(jié)果與供毒細(xì)菌一致。

表2 致病性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對(duì)氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢拉啶、克林霉素、氟甲砜霉素、強(qiáng)力霉素高敏。羅紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星中度敏感。慶大霉素、新霉素、青霉素不敏感。

4 討 論

豬鏈球菌2 型的死亡率和感染率都比較高，為了能更快的控制豬鏈球菌2型引起的感染，從病死豬病料中分離鑒定出豬鏈球菌2型，是臨床診治的重要病原學(xué)依據(jù)。從藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，平時(shí)認(rèn)為比較高效的藥物其敏感性卻很低，多表現(xiàn)耐藥，很多地區(qū)藥敏試驗(yàn)結(jié)果都有較大的差異，這和臨床上濫用抗生素有極大的關(guān)系。所以對(duì)于豬鏈球菌病的治療，早期可以聯(lián)合用藥，最好在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上再選用敏感性較高的藥物治療。采取綜合防治措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，適當(dāng)?shù)膶?duì)癥治療[6]。

5 小 結(jié)

本研究從撫順地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)中收集患有豬鏈球菌病的組織病料，通過分離培養(yǎng)得到9 株細(xì)菌株，生化實(shí)驗(yàn)確定這些菌株和豬鏈球菌性質(zhì)相似，血清型實(shí)驗(yàn)證明了只有1 個(gè)血清型：2 型。小鼠致病性實(shí)驗(yàn)表明，這些菌株致病型強(qiáng)，死亡率為100%。藥敏實(shí)驗(yàn)中，撫順地區(qū)分離的豬鏈球菌對(duì)氟甲砜霉素最為敏感，可以作為治療豬鏈球菌病的藥物。另外，分離菌株對(duì)氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢拉啶、克林霉素、強(qiáng)力霉素高敏。在實(shí)際臨床中考慮到用藥成本，采取綜合治療措施，在使用疫苗的基礎(chǔ)上，發(fā)病豬只用少量的敏感藥物作為輔助治療，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對(duì)鏈球菌病的防治能取得比較好的效果。