PINK1/Parkin介導的線粒體自噬及其在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制

張 浩，張 悅，趙文武，張敬各

1 河北醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，石家莊 050017；2 河北醫(yī)科大學病理生理學教研室，石家莊 050017

線粒體自噬指在活性氧(ROS)、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內(nèi)線粒體發(fā)生去極化并出現(xiàn)損傷，當抗氧化劑和細胞因子無法完成對線粒體的修復時，線粒體自噬會選擇性對整個線粒體進行降解[1]，受損線粒體被選擇性地包裹進入自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成受損線粒體的降解清除，對維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用[2]。

目前發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬的調(diào)控機制主要包括自噬相關(guān)基因(ATGs)、PINK1-Parkin途徑、BCL-2家族成員BNIP3/NIX介導的線粒體自噬等，其中PINK1/Parkin途徑被認為是線粒體自噬的主要途徑。

1 PINK1/Parkin介導的線粒體自噬機制概述

PINK1是線粒體自噬的“監(jiān)測者”，其在線粒體外膜水平的高低是線粒體自噬過程啟動與否的重要因素[3]。在正常線粒體上，PINK1通過線粒體外膜和內(nèi)膜復合物被移至內(nèi)膜之后被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，因此處于較低水平；當線粒體損傷時，內(nèi)膜復合物會被多種損傷因素如膜電位降低干擾，繼而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對PINK1的降解被阻斷，PINK1與外膜復合物以2∶1摩爾比率在線粒體外膜積聚并募集胞質(zhì)Parkin至線粒體外膜。一方面，PINK1可通過磷酸化泛素而募集非磷酸化Parkin；另一方面，PINK1磷酸化 Parkin使其與磷酸化的泛素結(jié)合而活化，然后泛素化線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2等，泛素化蛋白進一步促進PINK1磷酸化泛素，形成一個可使泛素鏈快速聚合的正反饋，泛素鏈與自噬相關(guān)蛋白p62結(jié)合進而誘導受損線粒體靶向LC3陽性的吞噬體，并在溶酶體中清除，完成線粒體自噬[4](圖1)。

PINK1下游因子Parkin是一種E3泛素連接酶，具有RING-in-between-RING結(jié)構(gòu)而借由泛素化底物蛋白完成標記，誘導底物分子通過蛋白酶體或自噬途徑進行降解[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬除受TOMM7、HspA1L、BAG4等大分子調(diào)控外，也受具Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)結(jié)構(gòu)的小分子調(diào)控。

2 線粒體自噬與肝臟相關(guān)疾病

線粒體自噬的失調(diào)將導致多種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病、癌癥和心血管疾病等[8-9]。近年研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬也參與了肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝纖維化、肝細胞癌(HCC)等，闡明這些疾病的發(fā)病機制可能為臨床治療疾病提供新的線索和思路。

2.1 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) NAFLD是一種病變主體在肝小葉以肝細胞中脂肪變性和脂質(zhì)沉積為病理特征但無過量飲酒史的代謝應(yīng)激性肝損傷，由于肝細胞中大量的脂肪沉積而導致氧化應(yīng)激和脂毒性，可通過多種機制促進線粒體功能障礙[10,14]。已成為我國第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生物化學指標異常的首要原因。Mst1是一種細胞存活調(diào)劑因子，已被公認為控制線粒體自噬激活的主要抑制劑，Mst1可以阻斷AMPK-PINK1通路，從而減少Parkin表達，抑制線粒體自噬[10]。有研究[8]表明，NAFLD中，高脂應(yīng)激引起了Mst1的活化，從而促進了肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激和炎癥損傷，敲除Mst1基因，可以減輕高脂飲食(high-fat diet，F(xiàn)DH)介導的肝損傷，維持肝細胞存活。NLR家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3，NLRP3)，是NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展的關(guān)鍵因素[14]，研究發(fā)現(xiàn)，線粒體ROS是調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵信號之一，線粒體自噬可能通過清除受損的線粒體調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量，從而防止ROS誘導NLRP3炎性小體活化[15]。艾塞那肽可通過增加LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Parkin、BNIP3L蛋白的表達和自噬小體的數(shù)量，增強線粒體自噬，從而清除過度損傷的線粒體，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制NLRP3炎性小體的活化，延緩NAFLD的進展[16]。HFD在體內(nèi)和體外均可干擾肝臟正常脂質(zhì)代謝，槲皮素可促進線粒體外膜蛋白CISD1和TOM20的Parkin泛素化，逆轉(zhuǎn)HFD導致的PINK1、Beclin1、LC3、p62和Parkin蛋白水平下降，促進PINK1-Parkin依賴的線粒體自噬, 極大地逆轉(zhuǎn)HFD誘導的肝脂代謝紊亂和線粒體損傷，改善線粒體的形態(tài)和功能，減輕肝臟脂肪變性[17]。Chen等[18]最新研究證明低劑量氯乙烯即可加重HFD誘導的肝臟損傷，該損傷可由Alda-1激活的PINK1/Parkin依賴的線粒體自噬所減輕。這些實驗均證明，PINK1-Parkin介導的線粒體自噬在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

2.2 肝纖維化 四氯化碳(CCl4)是一種廣泛應(yīng)用于實驗動物的致肝損傷和肝纖維化的毒物，可導致膠原沉積、肝細胞損傷、氧化應(yīng)激和肝星狀細胞(HSC)活化[19]。在慢性CCl4暴露的肝臟中，p62表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，PINK1和Parkin蛋白表達降低[20]，提示線粒體自噬受到損害。慢性CCl4暴露可以導致乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)缺乏，同時ROS大量產(chǎn)生，加重了肝細胞凋亡，抑制了線粒體自噬，同時加重了肝損傷和肝纖維化。ALDH2的特殊激活劑Alda-1可以通過激活A(yù)LDH2上調(diào)Nrf2/HO-1抗氧化途徑和PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，顯著減輕肝纖維化[11]。褪黑激素可以調(diào)節(jié)線粒體吞噬和線粒體生物發(fā)生，減輕慢性CCl4暴露誘導的Parkin相關(guān)的線粒體自噬的損傷[20]。顆粒物PM2.5可誘導ROS大量產(chǎn)生，導致線粒體廣泛損傷，從而間接激活PINK1/Parkin通路，觸發(fā)線粒體自噬，而線粒體自噬可以通過分解脂滴為激活HSC提供能量，進而促進肝纖維化的發(fā)生[21]；關(guān)于逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究[22]發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬的激活誘導HSC的細胞凋亡，其中凋亡調(diào)節(jié)因子BCL-B是線粒體自噬激活的重要機制，BCL-B過表達抑制未活化的Parkin磷酸化和直接結(jié)合活化的Parkin進而直接抑制線粒體自噬。以上研究均表明，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬參與了肝纖維化的發(fā)生，通過調(diào)節(jié)PINK1/Parkin途徑，增強線粒體自噬，可能是肝纖維化治療的一種有效手段。

2.3 肝細胞癌(HCC) 原發(fā)性肝癌起病隱匿且進展迅速，大多數(shù)患者在確診時已處于局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，導致患者治療困難、預(yù)后很差，是腫瘤相關(guān)死亡中的第4大癌癥[23]。HCC占原發(fā)性肝癌的90%以上，但其具體發(fā)病機制卻仍未完全闡明。與正常肝組織相比，超過50%的HCC中的Parkin表達降低，進一步研究[12]證明Parkin基因為肝癌的一個抑癌基因，TCGA數(shù)據(jù)庫的分析表明，Parkin在各種癌癥中的下調(diào)可能是由于Parkin的雜合性和拷貝數(shù)的丟失；然而Parkin表達下降不能僅僅根據(jù)雜合性或拷貝數(shù)的丟失來解釋，未來的研究應(yīng)該檢測Parkin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因的表觀遺傳修飾或Parkin的翻譯后修飾是否在癌癥中發(fā)生了改變[13]。Parkin基因缺失上調(diào)卵泡抑素使肝細胞以卵泡抑素依賴的方式抗凋亡，從而引起HCC的發(fā)生[24]。近期研究[12]發(fā)現(xiàn)，Parkin的表達水平還與HCC患者生存期有關(guān)，Parkin表達水平越低生存時間越短，而Parkin表達水平越高生存時間越長。此外，有研究報道將Parkin過表達的肝癌細胞植入裸鼠肝臟，建立原位腫瘤模型，與對照組相比，其腫瘤體積顯著減少，說明Parkin在體內(nèi)抑制了肝癌細胞的生長[12]，Parkin可以抑制多種癌細胞和肝細胞凋亡，p53誘導的細胞凋亡是其抑癌作用重要機制[25]，然而未有實驗探究在肝癌細胞中Parkin是否通過p53的激活或p53介導的細胞凋亡來發(fā)揮其抑癌作用。HCC幾乎對所有細胞毒性和靶向藥物有耐藥性，這是治療失敗和腫瘤復發(fā)的重要原因，shRNA篩選研究[26-27]顯示，線粒體促肽酶導致腫瘤細胞對索拉非尼(一種用于治療晚期HCC的多激酶抑制劑)的耐藥，沉默線粒體促肽酶的β亞基通過增強HCC中的PINK1-Parkin信號通路下調(diào)髓樣細胞白血病蛋白-1(Myeloid cell leukemia-1，MCL-1)，增加肝癌細胞對索拉非尼治療的敏感性，提高索拉非尼治療肝癌小鼠的存活率，研究支持了PINK1-Parkin信號通路在肝臟腫瘤發(fā)展和治療中的保護作用。目前正在開發(fā)和測試幾種MCL-1特異性小分子抑制劑，其中AMG176是第1個經(jīng)過Ⅰ期測試的MCL-1抑制劑，可與索拉非尼聯(lián)合使用，但在人體試驗中使用多種藥劑是否會有肝毒性作用仍不可得知[27]。蛋白酶體抑制劑最初被開發(fā)為具有潛在預(yù)防腫瘤生長的抗癌藥物[28]，體內(nèi)和體外實驗中，在Parkin過表達的條件下，硼替佐米(一代蛋白酶體抑制劑)可下調(diào)核因子-κB誘導的肝癌細胞在體內(nèi)的凋亡，而Parkin對正常的肝細胞并無調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用，說明靶向Parkin治療只影響癌細胞的細胞凋亡，而不影響正常細胞的細胞凋亡[12]，針對Parkin分子的靶向藥物可能為解決HCC耐藥性提供新的思路。傳統(tǒng)中藥苦參堿和海百合中提取物Ala(Alantolactone)可通過抑制PINK1/Parkin依賴的線粒體自噬實現(xiàn)對HepG2細胞的抗增殖和促凋亡作用[29-30]，也提示了針對PINK1/Parkin通路治療HCC的可行性。

3 結(jié)語與展望

線粒體作為真核細胞的主要產(chǎn)能細胞器保障了細胞的正常生命運動，然而外界的各種因素可導致線粒體損傷、衰老及功能紊亂，進一步損害細胞。線粒體自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要一環(huán)，近年來，隨著對線粒體自噬的深入研究，PINK1/Parkin通路的臨床醫(yī)學價值漸漸顯現(xiàn)出來。但目前對于自噬與肝臟的研究尚處于起步階段，研究較少且研究結(jié)果不盡一致，例如，目前大多實驗證據(jù)指向自噬的缺陷有助于肝細胞脂肪變性和肝纖維化，但也有實驗表明自噬參與脂肪的生成和分化；PM2.5可通過觸發(fā)線粒體自噬進而促進肝纖維化的發(fā)生，這表明線粒體自噬在肝臟疾病進展中可能有雙面作用。故對于兩者的關(guān)系有待于更多實驗來驗證，才能明確如何調(diào)節(jié)線粒體自噬來更好的治療肝臟疾病。Parkin表達上調(diào)可抑制肝癌細胞生長和提高肝癌小鼠生存期，對PINK1/Parkin通路處理聯(lián)合抗腫瘤藥物可提高藥物療效，探究其抑癌的機制可能為發(fā)展緩慢的肝癌藥物治療提供一個新思路，但考慮到不同病因的HCC表現(xiàn)出不同腫瘤標記物、抗原和進展過程，是否將PINK1/Parkin通路納入HCC個體治療的參考因素尚待進一步研究。