有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合水飛薊賓對(duì)阻塞性黃疸小鼠模型腸黏膜屏障的影響

彭律成，邵長(zhǎng)鳳，陳嘉勤，陳 偉,3

1 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425100；2 湖南師范大學(xué) 體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410006；3 湖南體育職業(yè)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410019

阻塞性黃疸(obstructive jaundice,OJ)指肝管梗阻后膽汁排泄不暢，膽紅素反流入血，而出現(xiàn)鞏膜及其全身皮膚黃染，也稱為外科黃疸[1]。腸道膽汁缺乏會(huì)使腸黏膜屏障受到破壞，腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身性炎癥及多器官功能障礙[2-4]。目前OJ對(duì)腸黏膜屏障的影響已成為熱點(diǎn)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)能直接或間接與炎癥通路的很多關(guān)鍵基因作用。miRNA-21是迄今研究的最為廣泛的miRNAs之一[6]。有研究[7-8]報(bào)道，miRNA-21參與了缺血后處理抗腸缺血再灌注損傷的調(diào)控過程，其已成為抗炎反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因子。Toll樣受體4(TLR4)可通過激活其下游效應(yīng)因子NF-κB，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。新近研究[10]證實(shí)，TLR4是miRNA-21的下游靶蛋白。miRNA-21過表達(dá)可通過抑制TLR4及其下游 NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達(dá)。但miRNA-21/TLR4/NF-κB通路是否參與了OJ腸損傷的調(diào)控過程，尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。作為天然多酚類黃酮，水飛薊賓具有抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗脂氧酶等活性，可以減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并減輕結(jié)腸黏膜屏障的損傷[11-12]。有氧運(yùn)動(dòng)作為一種簡(jiǎn)單、易行且經(jīng)濟(jì)的臨床康復(fù)治療手段，對(duì)OJ肝損傷具有改善作用[13-14]，同時(shí)可以改善腸缺血再灌注、炎癥性腸病和結(jié)腸癌腸黏膜損傷。但有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓，以及聯(lián)合干預(yù)在OJ腸損傷中的作用及機(jī)制，鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究利用本課題組膽總管結(jié)扎法，采用手術(shù)線直角懸掛膽總管72 h構(gòu)建小鼠OJ模型，探討有氧運(yùn)動(dòng)及水飛薊賓對(duì)OJ小鼠腸黏膜屏障的影響及可能的交互效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：Trizol(Inventragtion)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKA-RA，美國(guó))、mRNA引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、miRNA-21 引物(Ribobio)、兔抗多克隆抗體TLR4、NF-κB(南京建成生物工程研究所)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)、TBil、ALT、AST、二胺氧化酶(DAO)、內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、D-乳酸試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。主要儀器：YD-6D型生物組織石蠟包埋機(jī)、YD-A生物組織攤烤片機(jī)、LEICA RM2235 切片機(jī)、WFG 7200型可見分光光度計(jì)、Bio-Rad CFX96Touch 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、倒置相差顯微鏡、高速低溫離心機(jī)、099C K54型電動(dòng)勻漿機(jī)、高性能超凈工作臺(tái)。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建與分組 選取成年健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證 SCXK〔Xiang〕2016-0002)。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)1周后，參照本課題組大鼠膽總管結(jié)扎構(gòu)建OJ模型[15]并加以改進(jìn), 構(gòu)建一種新的膽總管短期(72 h)懸掛OJ小鼠模型。操作如下：麻醉狀態(tài)下，鑷子夾起腹部皮膚，剪刀縱向開1～1.5 cm切口，暴露肝臟。距肝門1 cm處分離膽總管，4-0不可吸收手術(shù)線將其懸掛于腹壁。假手術(shù)組小鼠僅在腹部開同等長(zhǎng)度切口，縫合。小鼠放籠飼養(yǎng)，待自然蘇醒。2 d后解除懸掛，復(fù)位膽總管。構(gòu)建OJ模型成功的小鼠隨機(jī)分為模型組(M)、有氧運(yùn)動(dòng)組(E)、水飛薊賓組(S)和有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合水飛薊賓組(ES)，另設(shè)假手術(shù)組(GO)，每組10只。

1.3 干預(yù)方案 確定小鼠運(yùn)動(dòng)能力正常，E組和ES組采用中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練，訓(xùn)練前進(jìn)行為期1周的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度適應(yīng)，固定于每天下午4點(diǎn)。第1～2天，設(shè)置運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)坡度為0°，速度6 m/min，訓(xùn)練25 min/d；第3～4天，設(shè)置運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)坡度為5°，速度8 m/min，訓(xùn)練40 min/d；第5～6天設(shè)置運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)坡度為8°，速度10 m/min，訓(xùn)練1 h/d。之后保持此強(qiáng)度共訓(xùn)練至第7周，每周休息1 d。S組和ES組按人與小鼠體表面積折算等效劑量經(jīng)口灌胃(200 mg/kg體質(zhì)量，0.4 ml生理鹽水進(jìn)行溶解)。GO組、M組和E組進(jìn)行相同體積的生理鹽水灌服，1次/d，共7周。

1.4 樣品采集與處理 干預(yù)7周后，小鼠禁食過夜，2%戊巴比妥鈉(500 mg/kg)麻醉，確認(rèn)無翻轉(zhuǎn)反射后，眼科鑷子摘眼球取血至5 ml 抗凝管中，4 ℃、4500 r/min 離心15 min，吸取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。手術(shù)剪開腹，分離組織，暴露小腸段，距回盲部約3cm處，向近端依次切取末端回腸3段，每段約1 cm，生理鹽水洗凈回腸組織，最末端加入1 ml Trizol，儲(chǔ)存于-80 ℃；次末端液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃，用于檢測(cè)基因和蛋白表達(dá)；近端用10%多聚甲醛固定，備用于相關(guān)染色。

1.5 病理學(xué)觀察 回腸組織石蠟切片，厚度4 μm，脫蠟、乙醇梯度脫水，HE染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠進(jìn)行封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察回腸組織的形態(tài)。

1.6 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TBil、ALT和AST；速率法檢測(cè)血清中DAO活性；ELISA法檢測(cè)血清D-乳酸水平。采用終點(diǎn)顯色法(顯色基質(zhì))定量檢測(cè)內(nèi)毒素含量，Bradford法測(cè)定回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白含量。

1.7 免疫組化染色 回腸組織石蠟切片，厚度4 μm，步驟按說明書操作，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)檢測(cè)回腸組織中TLR4、NF-κB及TNFα陽性表達(dá)，用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，Olympus光學(xué)顯微鏡下計(jì)算陽性表達(dá)面積百分比。

1.8 real-time PCR檢測(cè)及高通量測(cè)序

1.8.1 回腸組織總RNA提取 按照說明書使用高容量的cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。使用 Prime Script?RT Master Mix Perfect Real Time kit 定量檢測(cè)TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)水平，One Step Prime Script?miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 SYBR Green PCR Master Mix Kit(Applied biosystems)PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄與定量miRNA-21基因水平。qRT-PCR使用 CFX Connect PCR 系統(tǒng)(BioRad，USA)進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，GAPDH和U6作為內(nèi)部參照。根據(jù)GeneBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中神經(jīng)組織各因子cDNA 序列，TLR4、NF-κB、TNFα mRNA基因引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)，miRNA-21、U6(內(nèi)參基因)亦按照miR Base database 數(shù)據(jù)庫(kù)中的堿基由廣州 Ribobio生物科技有限公司提供。PCR 檢測(cè)過程每樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)試結(jié)果采用 2-△△Ct法計(jì)算組織中基因表達(dá)水平，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-校正組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

表1 mRNA基因引物序列

1.8.2 高通量測(cè)序 提取檢測(cè)樣本肝組織總RNA，待瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase Ⅰ合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。采用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序策略為SE50，DEGseq基因表達(dá)分析不同組別測(cè)序結(jié)果的差異性，選取|log2Ratio|≥1與q<0.05的差異表達(dá)基因，獲取上下調(diào)差異表達(dá)基因。

1.9 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)科學(xué)研究項(xiàng)目審批(批號(hào)：2018183)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在模型構(gòu)建過程中，建模小鼠均未出現(xiàn)由手術(shù)或其他原因造成的死亡情況。梗阻約48 h，小鼠嗜睡，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)雜亂、無光澤，尿色變黃。梗阻72 h左右，小鼠尾巴、耳尖及腹部開始出現(xiàn)皮膚黃染，大便色淺、量少，個(gè)別小鼠呈現(xiàn)便秘狀態(tài)，解剖發(fā)現(xiàn)構(gòu)模小鼠膽管懸掛處出現(xiàn)囊性擴(kuò)張，肝臟呈淤膽樣改變。有氧運(yùn)動(dòng)及水飛薊賓干預(yù)7周后，相比M組，E組、S組、ES組OJ生理病理癥狀明顯減輕。

2.2 回腸組織病理學(xué)改變 圖1可見，GO組小鼠腸黏膜正常，腺體、絨毛形態(tài)正常，腺上皮排列整齊，基底膜及肌層完整。M組腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，絨毛稀疏、變細(xì)，部分腺體萎縮且高度不均，脫落，間質(zhì)水腫，局部有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層萎縮。E組腸黏膜結(jié)構(gòu)有所改善，腺體排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，水腫消失，少有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。S組腺上皮排列整齊，腺體分泌活躍。ES組長(zhǎng)絨毛形態(tài)，接近正常腸上皮。

2.3 肝功能測(cè)定結(jié)果 M組小鼠血清TBil、ALT 和AST水平最高；E組、S組血清TBil、ALT和AST水平較M組均明顯降低(P值均<0.01)；與E組、S組相比，ES組TBil、ALT 和AST水平降低(P值均<0.05)(表2)。且有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓間對(duì)血清TBil、ALT 和AST水平存在協(xié)同作用(P值均<0.05)。

表2 各組血清TBil、ALT、AST水平的比較

2.4 血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果 M組血清中腸屏障功能指標(biāo)DAO、D-乳酸及內(nèi)毒素水平最高;相比M組，E組、S組和ES組血清中DAO、D-乳酸水平及內(nèi)毒素水平均下降(P值均<0.05)；相比E組、S組，ES組DAO與D-乳酸水平下降均具有非常顯著性差異(P值均<0.01)，內(nèi)毒素水平下降具有顯著性差異(P<0.05)(表3)。對(duì)于上述指標(biāo)，除DAO水平以外，有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓間均存在協(xié)同作用(P值均<0.05)。

表3 腸屏障功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.5 回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα免疫組化染色結(jié)果TLR4免疫陽性細(xì)胞呈棕褐色，NF-κB、TNFα呈淡藍(lán)色，胞體染色深，胞核不著色(圖2)。GO組中小鼠腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白陽性表達(dá)面積最低，M組表達(dá)最高；相比M組，E組、S組、ES組各炎性因子蛋白陽性面積均顯著下降(P值均<0.01)，相比E、S組，ES組各因子陽性表達(dá)面積降低(P值均<0.01)(表4)。對(duì)于NF-κB、TNFα蛋白表達(dá)，有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓間具有協(xié)同作用(P值均<0.05)。

表4 相關(guān)因子蛋白陽性表達(dá)面積

2.6 回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平檢測(cè) M組肝組織中TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平最高，ES組最低。相比M組，E組、S組、ES組肝組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平均顯著降低(P值均<0.05)；相比E組、S組，ES組TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平均具有明顯降低趨勢(shì)(P值均<0.05)(表5)。除NF-κB蛋白水平外，有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓對(duì)TLR4、TNFα蛋白水平的升高具有協(xié)同作用(P值均<0.05)。

2.7 高通量測(cè)序的KEGG功能富集關(guān)聯(lián)分析 實(shí)驗(yàn)為探究不同組別樣本轉(zhuǎn)錄組間差異，主要對(duì)E組與M組、E組與ES組、S組與ES組間肝組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，共鑒定出10 657個(gè)差異表達(dá)基因，含7415個(gè)上調(diào)基因，3242個(gè)下調(diào)基因，其主要在炎癥信號(hào)通路激活后誘發(fā)，與炎性因子釋放密切相關(guān)，以及涉及參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞損傷修復(fù)和心血管神經(jīng)變性的相關(guān)蛋白抑制劑等。高通量測(cè)序結(jié)果顯示共207個(gè)差異表達(dá)基因富集于60個(gè)KEGG通路，主要參與肝纖維化發(fā)病機(jī)制、TNFα通路、膽汁分泌、NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)、TLR-NF-κB 信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通路等。另細(xì)胞增殖、分化、硫代謝、多巴胺等差異表達(dá)基因也富集于KEGG 通路，雖不具非常顯著性差異，但差異表達(dá)基因所對(duì)應(yīng)的富集通路具有一定意義。

表5 回腸組織相關(guān)因子蛋白水平檢測(cè)

2.8 回腸組織miRNA-21/TLR4/NF-κB通路軸相關(guān)因子基因表達(dá) 相比M組，7周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后E組、S組、ES組miRNA-21基因表達(dá)均顯著升高(P值均<0.05)，相比E組、S組，ES組miRNA-21基因表達(dá)顯著升高(P值均<0.01)。M組小鼠TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)最高(P值均<0.01)。與M組比較，E組、S組TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)顯著降低(P值均<0.01)；與E組、S組相比，ES組TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)顯著下降(P值均<0.01)(表6)。除miRNA-21 mRNA表達(dá)水平外，有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓對(duì)于TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)存在協(xié)同效應(yīng)(P值均<0.05)。

表6 回腸組織miRNA-21、TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)

3 討論

膽汁是肝臟合成及分泌的一種復(fù)雜水溶液，對(duì)于小腸中脂肪和脂溶性維生素的消化和吸收至關(guān)重要。此外，膽汁是消除過量膽固醇、內(nèi)毒素、膽紅素、藥物和有毒化合物的重要途徑[16]。多種原因誘發(fā)膽汁分泌或排泄障礙時(shí)，造成肝臟內(nèi)毒性和代謝廢物的堆積，膽汁酸與膽紅素在機(jī)體體循環(huán)中含量增加，同時(shí)由于腸道膽汁缺乏，腸道細(xì)菌繁殖受到抑制及腸源性內(nèi)毒素降解減慢，呈現(xiàn)膽汁淤積性病變，致使腸屏障功能障礙，促進(jìn)細(xì)菌移位，炎性因子“瀑布樣”效應(yīng)，對(duì)多器官生理功能造成影響[17]。膽汁的分泌與排泄信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要依靠肝細(xì)胞、膽管腸細(xì)胞膜上相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。Chiang等[18]研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸對(duì)于保護(hù)肝臟和其他組織及細(xì)胞免受膽固醇和膽汁酸毒性至關(guān)重要。同時(shí)也是維持腸屏障功能穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，膽汁酸穩(wěn)態(tài)的改變將導(dǎo)致膽汁淤積性肝病、腸道消化系統(tǒng)炎性疾病、肥胖癥和糖尿病。Yang等[19]采用內(nèi)毒素血癥的大鼠膽汁對(duì)正常小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝組織巨噬細(xì)胞向膽汁中釋放了大量的炎癥細(xì)胞，且膽汁流速顯著下降，黏膜通透性和腸道細(xì)菌易位性增加。本實(shí)驗(yàn)中，高通量測(cè)序KEGG分析顯示，OJ小鼠肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的蛋白分子發(fā)生活性變化，肝胞質(zhì)膜鈉依賴?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)體、多耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance,MRP)3、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、膽鹽輸出泵(BSEP)等活性下降，MRP4和MRP1活性增加，明顯降低膽汁酸排泄和膽汁流量。血清腸屏障功能指標(biāo)DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平顯著上升，回腸組織顯微結(jié)構(gòu)病理改變明顯，同時(shí)肝功能指標(biāo)AST、ALT和TBil水平增加，結(jié)合小鼠一般行為學(xué)觀察結(jié)果。提示，OJ小鼠構(gòu)模成功，并導(dǎo)致腸屏障功能受損，但是否與炎性因子的釋放有關(guān)尚未確定。

miRNAs是一類內(nèi)源性表達(dá)的、具有多種調(diào)控功能的非編碼RNA，其長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸，它可以和靶基因mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，促使沉默復(fù)合體對(duì)mRNA進(jìn)行降解，或干擾其翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、氧化應(yīng)激等生理過程[20]。近年來，miRNA對(duì)腸道屏障功能的調(diào)控作用正逐漸被揭示。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多miRNA分子在腸黏膜組織中表達(dá)異常，引起腸黏膜組織內(nèi)免疫功能紊亂，損傷腸上皮細(xì)胞屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜組織內(nèi)異常炎癥免疫反應(yīng)。miRNA-126通過抑制靶基因S1PR2激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞屏障功能受損[21]；miRNA-10a在炎癥性腸病患者及小鼠炎癥腸黏膜組織中表達(dá)降低，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，據(jù)報(bào)道m(xù)iRNA-21參與了缺血后處理抗腸缺血再灌注損傷的調(diào)控過程[22]，已成為抗炎反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵媒介。對(duì)于TLR4與miRNA-21的研究也有部分報(bào)道，新近研究[23]證實(shí)，TLR4 是miRNA-21的下游靶蛋白。miRNA-21過表達(dá)可通過抑制 TLR4 及其下游 NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達(dá)[11]。提示miRNA-21可能具有通過調(diào)控TLR4通路而影響腸黏膜損傷發(fā)生、進(jìn)展的潛在作用。然而，miRNA-21/TLR4/NF-κB是否參與OJ腸黏膜損傷過程，仍未得到充分的證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中，M組miRNA-21表達(dá)水平高于GO組，表明OJ小鼠腸組織miRNA-21應(yīng)激性升高。TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路激活，促進(jìn)下游TNFα等炎性信號(hào)因子的活化，造成炎癥瀑布式效應(yīng)，結(jié)合血生化及組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，提示OJ小鼠可能激活miRNA-21/TLR4/NF-κB通路誘發(fā)炎癥。免疫組化染色及回腸組織蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，TLR4、NF-κB、TNFα陽性表達(dá)面積及蛋白水平顯著上升，結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步表明miRNA-21/TLR4/NF-κB通路參與了OJ所導(dǎo)致的腸黏膜上皮細(xì)胞炎性損傷過程，且膽汁排泄障礙可激活miRNA-21/TLR4/NF-κB炎性通路軸，致使腸屏障功能炎性損傷。

有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓抑炎的作用早已被證實(shí)，但其是否對(duì)miRNA-21起到調(diào)控作用，進(jìn)而下調(diào)其靶基因TLR4信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮抑炎作用在很大程度上仍是未知的。多項(xiàng)研究表明，間歇和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)miRNAs具有調(diào)控作用[24]。Baggish等[25]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)相關(guān)miRNAs 的變化，如血管生成(miRNA-20a、miRNA-210、miRNA-221、miRNA-222和miRNA-328)、炎癥(miRNA-21和miRNA-146a)、心肌和骨骼肌的收縮(miRNA-21和miRNA-133a)、肌肉對(duì)低氧和缺血的適應(yīng)(miRNA-21、miRNA-146a和miRNA-210)。Dimassi等[26]探討了9種miRNAs對(duì)有氧運(yùn)動(dòng)在肥胖調(diào)節(jié)炎癥和血管功能中的作用。根據(jù)孟憲欣等[27]的前期報(bào)道，長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)下調(diào)miRNA-214表達(dá)可有效抑制NF-κB活性從而使結(jié)腸炎癥得到改善，保護(hù)炎癥性腸病腸黏膜損傷。水飛薊賓是一種傳統(tǒng)草藥，可以抑制腸道腫瘤細(xì)胞的活力，并抑制腸道炎癥。在不同的細(xì)胞模型中, 水飛薊賓都顯示對(duì)NF-κB等多種炎癥因子活性的抑制作用。但目前有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合水飛薊賓對(duì)OJ致腸屏障功能損傷的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，7周有氧運(yùn)動(dòng)和水飛薊賓灌胃干預(yù)后，一般情況觀察黃疸癥狀明顯改善，血清AST、ALT和TBil水平顯著降低，且有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓間存在協(xié)同作用。腸黏膜病理結(jié)構(gòu)改善顯著，腺體排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，水腫消失，少有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。血清腸屏障功能指標(biāo)DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平下降，除DAO水平外，有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓間存在協(xié)同作用。結(jié)合回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα陽性表達(dá)面積及蛋白水平降低結(jié)果，表明有氧運(yùn)動(dòng)、水飛薊賓干預(yù)與OJ后腸屏障功能的穩(wěn)定及炎癥因子的介導(dǎo)密切相關(guān)，且有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓對(duì)炎性因子的調(diào)控存在協(xié)同效應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證有氧運(yùn)動(dòng)、水飛薊賓與TLR4/NF-κB炎性通路間的關(guān)系，本研究對(duì)M組、E組、S組與ES組小鼠肝組織進(jìn)行mRNA高通量測(cè)序，且對(duì)其測(cè)序結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合miRNA-21、TLR4、NF-κB、TNFα基因表達(dá)結(jié)果，有氧運(yùn)動(dòng)、水飛薊賓可顯著升高miRNA-21 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)TLR4/NF-κB通路軸，抑制單核細(xì)胞等分泌TNFα炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)一系列生理(免疫反應(yīng)性強(qiáng)化)和病理(炎癥)反應(yīng)，保護(hù)腸黏膜屏障功能，除miRNA-21基因水平外，有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓對(duì)于TLR4、NF-κB、TNFα基因表達(dá)存在協(xié)同作用。

miRNA-21/TLR4/NF-κB通路軸對(duì)OJ小鼠致腸屏障功能炎性損傷具有重要調(diào)控作用，7周有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓可促進(jìn)miRNA-21高表達(dá)，顯著下調(diào)TLR4的表達(dá)，促進(jìn)炎性因子NF-κB、TNFα低表達(dá)，對(duì)腸黏膜屏障的炎性損傷發(fā)揮了較明顯的保護(hù)作用，且有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合水飛薊賓干預(yù)效果更佳，在腸屏障功能的恢復(fù)及炎癥反應(yīng)的抑制上，有氧運(yùn)動(dòng)與水飛薊賓間存在協(xié)同效應(yīng)。