3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽管細(xì)胞損傷型藥物性肝損傷患者肝組織中的表達(dá)特點(diǎn)及意義

葉立紅，鄭歡偉，黃肖雨，郭立杰，張海叢，劉志權(quán)，王翀奎

1 石家莊市第五醫(yī)院 a.病理科; b.肝病中心; c.藥劑科，石家莊 050021；2 河北中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，石家莊 050200

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)的發(fā)病率逐年增加，并且是引起淤膽性肝炎最常見病因。證據(jù)表明，膽汁形成、分泌和排流障礙是導(dǎo)致膽汁淤積的主要機(jī)制，其中肝細(xì)胞膽汁分泌異常是其重要發(fā)生機(jī)制之一。位于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)上的3種主要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-ABCB11(膽汁酸鹽輸出泵，bile salt export pump，BSEP)、ABCC2(多藥耐藥相關(guān)蛋白2，multidrug resistance protein 2，MRP2)和ABCB4(多藥耐藥糖蛋白3，multidrug resistance associated protein 3，MDR3)對膽汁經(jīng)肝細(xì)胞分泌入毛細(xì)膽管發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1-2]。2015年中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的《藥物性肝損傷診治指南》[3]中，王泰齡教授根據(jù)藥物損傷靶點(diǎn)不同對DILI進(jìn)行了病理學(xué)分類，分為肝細(xì)胞損傷型、膽管細(xì)胞損傷型、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷型三大類。其中膽管細(xì)胞損傷型在病理形態(tài)上均表現(xiàn)為毛細(xì)膽管膽汁淤積伴/不伴肝細(xì)胞膽汁淤積，根據(jù)伴有肝細(xì)胞壞死程度的不同從病理上又分為3個(gè)亞型：混合性肝炎(肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重)、膽汁淤積性肝炎(肝細(xì)胞損傷輕)和單純性膽汁淤積(無肝細(xì)胞損傷)。BSEP、MRP2和MDR3表達(dá)異常與多種膽汁淤積性疾病相關(guān)，其在上述3種亞型中表達(dá)特點(diǎn)如何？是否也存在表達(dá)異常？三者表達(dá)特點(diǎn)與不同病理形態(tài)的膽汁淤積有何關(guān)系？以及與血清TBil、DBil、ALP、GGT、TBA水平是否存在相關(guān)性？因此，本研究通過對膽管細(xì)胞損傷型DILI不同病理亞型的肝組織進(jìn)行BSEP、MRP2、MDR3免疫組化及病理形態(tài)觀察，并對比與肝生化指標(biāo)的相關(guān)性，從而探討轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽管細(xì)胞損傷DILI各亞型中的表達(dá)特點(diǎn)及在膽汁淤積發(fā)生機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1月-2017年6月石家莊市第五醫(yī)院有明確用藥史、經(jīng)肝穿組織病理診斷為膽管細(xì)胞損傷型DILI的112例患者的臨床資料。根據(jù)2015年《藥物性肝損傷診治指南》[3]中的病理分類標(biāo)準(zhǔn)，對入選病例進(jìn)行明確病理分型，分為混合性肝炎組(混合組，n=40)、膽汁淤積性肝炎(膽汁淤積組,n=40)、單純性膽汁淤積組(單純組,n=32)，同時(shí)選取20例無膽汁淤積的HBV攜帶者作為對照組。所有患者均有明確用藥史，并排除原發(fā)性膽汁性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽道不全梗阻、酒精性肝病、脂肪性肝炎、嗜肝及非嗜肝病毒感染浩和遺傳代謝性疾病等。

1.2 主要試劑與儀器 BSEP(ABCB11)鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，MRP2(ABCC2)兔單克隆抗體、MDR3(ABCB4)兔多克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒(PV-6000)、DAB顯色液、抗體稀釋液購自北京中杉金橋試劑公司，主要儀器為美智Powerlmager Version5.3圖像采集系統(tǒng)、OLYMPUS BX53顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件。

1.3 研究方法

1.3.1 肝組織常規(guī)病理檢測 所有入選病例肝穿標(biāo)本均常規(guī)進(jìn)行HE染色、網(wǎng)狀纖維+Masson染色、淀粉酶消化過碘酸希夫法染色(D-PAS)、CK7/CK19免疫組化染色，病理形態(tài)觀察由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師共同閱片并進(jìn)行各病理亞型分組。

1.3.2 肝組織免疫組化檢測及結(jié)果判定 所有入選病例均切取3張石蠟切片，分別用于3種抗體的免疫組化標(biāo)記。免疫組化采用SP法進(jìn)行嚴(yán)格操作。PBS 代替第一抗體作為陰性對照。由于BSEP、MDR3、MRP2均表達(dá)于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)，因此免疫組化染色以在肝細(xì)胞膽管膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性表達(dá)，無著色為陰性表達(dá)。

1.3.3 圖像分析軟件進(jìn)行半定量評分 所有切片通過Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，圖像采集均在完全相同的顯微鏡條件下拍攝，并對圖像分析軟件設(shè)定統(tǒng)一選色參數(shù)。除由于肝細(xì)胞壞死消失而造成3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)缺失不作為觀察區(qū)域外，選取組織切片內(nèi)除壞死區(qū)外全部區(qū)域進(jìn)行顯微鏡下拍照分析。應(yīng)用圖像分析軟件分別測量BSEP、MRP2、MDR3在每張切片的陽性區(qū)域面積、平均光密度值、積分光密度值(integrated optical density，IOD)，IOD=陽性區(qū)域面積×平均光密度值。測量得到IOD數(shù)據(jù)作為半定量分析的有效指標(biāo)，并對不同組別間IOD值進(jìn)行相互比較。

1.3.4 觀察指標(biāo) 所有肝穿標(biāo)本均進(jìn)行連續(xù)切片，對比觀察每例病例組織切片內(nèi)的病變形態(tài)特點(diǎn)(包括肝細(xì)胞淤膽、羽毛樣變性、毛細(xì)膽管淤膽)及BSEP、MRP2、MDR3免疫組化陽性表達(dá)變化，并與對照組進(jìn)行對比分析；收集所有入選病例距肝穿時(shí)間最近一次肝生化指標(biāo)中TBil、DBil、ALP、GGT、TBA值，與BSEP、MRP2、MDR3半定量評分進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會審批(批號：SJZWY090112)，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 混合組40例患者中男18例(45%)，女22例(55%)，平均(45.6±15.4)歲；膽汁淤積組40例患者中男12例(30%)，女28例(70 %)，平均(43.2±15.1)歲；單純組32例患者中男14例(43.75%)，女18例(56.25%)，平均(47.4±19.0)歲。

2.2 病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 混合組：病理形態(tài)以中或重度的肝細(xì)胞壞死為主，壞死區(qū)周圍有肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽、膽栓形成(圖1a)。膽汁淤積組：病理形態(tài)以膽汁淤積為主，表現(xiàn)為肝細(xì)胞明顯腫脹、羽毛樣變性(膽鹽的毒性作用使受損肝細(xì)胞明顯腫脹、胞漿稀疏呈細(xì)網(wǎng)狀)，毛細(xì)膽管膽栓形成(圖1b)。膽汁淤積程度重于混合組，同時(shí)伴有輕度肝細(xì)胞壞死。單純組僅表現(xiàn)為中央靜脈周圍的毛細(xì)膽管淤膽、膽栓形成，肝細(xì)胞壞死輕微或無(圖1c)。

2.3 BSEP、MRP2、MDR3免疫組化表達(dá)特點(diǎn)及與病理形態(tài)的關(guān)系 膽汁淤積組、混合組、單純組分別與對照組比較，3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞膜上表達(dá)變化趨勢較一致，均表現(xiàn)為陽性表達(dá)減少(P值均<0.05)；BSEP、MRP2、MDR3在膽汁淤積組表達(dá)減弱較混合組及單純組更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。BSEP、MRP2、MDR3特異性定位于肝細(xì)胞膜，在正常對照組沿肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)呈微管狀陽性表達(dá)(圖2a)。各亞型組BSEP、MRP2、MDR3免疫組化表達(dá)特點(diǎn)及與病理形態(tài)的關(guān)系顯示：3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽汁淤積腫脹變性及羽毛樣變性的肝細(xì)胞呈陰性表達(dá)(圖2b)，在毛細(xì)膽管膽汁淤積區(qū)沿?cái)U(kuò)張的毛細(xì)膽管壁呈陰性或弱陽性表達(dá)(圖2c)，其余非膽汁淤積區(qū)三者呈現(xiàn)稀疏陽性表達(dá)，其中肝細(xì)胞膽汁淤積腫脹及羽毛樣變性越明顯，陽性表達(dá)減少越顯著。

表1 4組間BSEP、MRP2、MDR3免疫組化IOD均值(取自然對數(shù))的比較

2.4 各組肝生化指標(biāo)與3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白半定量評分的相關(guān)性 膽汁淤積組BSEP與TBA值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r=-0.640，P=0.008)，單純組MRP2與TBil、DBil值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r值分別為0.597、-0.643、P值分別為0.019、0.011)(表2)。

3 討論

肝臟是藥物代謝的重要器官，藥物誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積在臨床上較為常見，已知有數(shù)百種藥物能導(dǎo)致膽汁淤積型DILI的發(fā)生[4]。膽汁淤積的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，當(dāng)各種原因引起的膽汁形成、分泌、排泄障礙時(shí)均可導(dǎo)致膽汁淤積，其中肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能障礙是造成膽汁分泌異常的重要原因之一。膽汁由肝細(xì)胞分泌是一個(gè)需要主動耗能的排泌過程, 其分泌的膽汁酸鹽及一些非膽汁酸鹽的有機(jī)陰離子(例如膽紅素、磷脂)主要依靠肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜側(cè)上的3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP、MRP2和MDR3來共同介導(dǎo)完成[5-6]。這3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為ATP結(jié)合盒超家族成員，其表達(dá)異常是多種疾病中膽汁淤積的“原發(fā)事件”[7]。多數(shù)引起膽汁淤積的藥物都是ATP結(jié)合盒超家族成員反應(yīng)底物[8]，超家族成員與這類藥物反應(yīng)后會損傷毛細(xì)膽管細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而使膽汁排流障礙導(dǎo)致肝內(nèi)淤積。BSEP在正常肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)膽鹽平衡，通過ATP水解將膽汁酸鹽逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管，是形成毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁酸鹽依賴性膽汁流的主要驅(qū)動力[9]。BSEP表達(dá)降低，引起膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌減少，導(dǎo)致肝細(xì)胞膽汁酸蓄積，進(jìn)而對肝細(xì)胞造成毒性損害，血清中膽汁酸水平升高。MRP2為有機(jī)陰離子的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，是非膽汁酸鹽依賴性膽汁流形成的重要因素，也是唯一將結(jié)合膽紅素從肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10-11]。MRP2的表達(dá)減少會導(dǎo)致膽紅素分泌障礙及膽汁淤積、膽栓形成。MDR3為卵磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)。膽汁中的膽汁酸鹽、磷脂和膽固醇等主要有機(jī)溶質(zhì)常形成混合微粒，MDR3能有效的將磷脂從雙分子層膜內(nèi)側(cè)移至外側(cè)膜，使膽汁中的膽鹽和膽固醇易于形成混合微粒。MDR3表達(dá)水平降低會減少卵磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，使膽汁中卵磷脂含量下降，膽鹽不形成微膠粒，膽鹽游離引起膽管細(xì)胞損傷，導(dǎo)致膽汁淤積[12]。

既往研究[13-14]顯示，某些經(jīng)膽汁清除的藥物或其代謝產(chǎn)物可以通過抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能和(或)下調(diào)其表達(dá)，從而抑制膽汁分泌、膽汁酸運(yùn)輸導(dǎo)致膽汁淤積、高膽紅素血癥發(fā)生，是引起藥物性膽汁淤積的發(fā)生機(jī)制之一。本研究通過觀察BSEP、MRP2和MDR3在急性膽管細(xì)胞損傷型DILI各亞型肝組織中的表達(dá)變化以及與不同膽汁淤積形態(tài)改變的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽管細(xì)胞損傷型DILI各亞型組肝組織陽性表達(dá)減少甚至不表達(dá)，尤其以膽汁淤積腫脹及羽毛樣變肝細(xì)胞明顯區(qū)陽性表達(dá)減少更顯著，在毛細(xì)膽管膽栓形成的肝細(xì)胞膽管膜側(cè)三者表達(dá)呈弱表達(dá)或缺失，表明3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)均受到抑制，從而推測膽汁淤積性DILI發(fā)生發(fā)展與3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能或結(jié)構(gòu)受損密切相關(guān)；3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各亞型組相同肝組織中的表達(dá)強(qiáng)弱較一致，表明藥物引起的肝細(xì)胞或毛細(xì)膽管淤膽，不像遺傳性膽汁淤積性肝病為單一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常，而是會同時(shí)影響到3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)。各亞型組之間相互比較，膽汁淤積組3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少程度較混合組及單純組更明顯，尤其以羽毛樣變性及肝細(xì)胞淤膽腫脹的肝細(xì)胞減少為顯著，提示膽汁淤積組3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白損傷更嚴(yán)重，與膽汁淤積組的肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽重于其他兩組相一致。

TBil、DBil、ALP、GGT、TBA為反映肝臟膽管損傷及膽汁淤積的肝生化指標(biāo)，通過對各亞型組內(nèi)3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白評分與上述肝生化指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，膽汁淤積組BSEP表達(dá)評分與TBA峰值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性，考慮是與膽汁淤積組肝細(xì)胞羽毛樣變性較其他兩組為多見有關(guān)。羽毛樣變性是由于膽汁酸鹽的毒性作用引起得的受損肝細(xì)胞明顯腫脹的病理形態(tài)改變，負(fù)責(zé)膽汁酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的BSEP表達(dá)降低后造成肝細(xì)胞膽汁酸鹽分泌障礙，進(jìn)而引起血漿中膽汁酸水平升高，因此使得膽汁淤積組BSEP與TBA水平呈負(fù)相關(guān)性。而混合組和單純組羽毛樣變性相對少見或無，多以毛細(xì)膽管淤膽為主要淤膽形態(tài)改變，因此兩組BSEP與TBA水平無明顯相關(guān)性。此外，單純組MRP2評分與TBil、DBil峰值呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性，MRP2是唯一將膽紅素從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)減少使得膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管障礙。單純組僅有毛細(xì)膽管淤膽而無肝細(xì)胞壞死，使得影響TBil、DBil升高的因素主要為毛細(xì)膽管淤膽，因此MRP2與TBil、DBil呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性。而膽汁淤積組及混合組除了毛細(xì)膽管淤膽引起TBil、DBil升高外，還伴有不同程度的肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞壞死亦可引起TBil、DBil升高，使得這兩組的TBil、DBil與MRP2無明顯相關(guān)性。其他肝生化指標(biāo)與3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫組化評分均無明顯相關(guān)性(P值均>0.05)，這是由于藥物引起膽汁淤積的除了藥物或其代謝產(chǎn)物抑制3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞膽管膜上的表達(dá)外，還包括肝細(xì)胞和毛細(xì)膽管側(cè)微絲微管功能障礙, 細(xì)胞膜的流動性、Na+-K+-ATP酶活性等因素[15]，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)異常并非引起藥物性膽汁淤積發(fā)生的唯一因素。并且，影響上述肝生化指標(biāo)升高的因素也不僅包括肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽，肝細(xì)胞炎癥壞死、其他各級膽管上皮細(xì)胞的損傷亦均可引起上述各指標(biāo)的升高。

綜上所述，3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP、MDR3、MRP2在膽管細(xì)胞損傷型DILI各病理亞型均呈現(xiàn)表達(dá)水平降低，提示藥物或其代謝產(chǎn)物可損傷毛細(xì)膽管膜側(cè)3種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是膽管細(xì)胞損傷型DILI膽汁淤積發(fā)生的重要機(jī)制之一。