肝爽顆粒對新型組織工程肝臟非酒精性脂肪性肝病大鼠模型脂代謝的影響

張譯之，段鐘平，張曉慧，陳 煜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 疑難肝病及人工肝中心，肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室，北京 100069

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征、與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān)的臨床病理綜合征[1]。目前 NAFLD 已經(jīng)成為全球最主要的慢性肝病，2016年全球平均患病率為24%，其中亞洲患病率為27%[2-3]。NAFLD過去被認(rèn)為主要發(fā)生在西方發(fā)達(dá)國家，然而，近20年來隨著亞洲地區(qū)人民生活水平的提高，NAFLD在亞洲地區(qū)的患病率逐年升高[4]。因此，探索NAFLD發(fā)病的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)靶點是亟待解決的問題。目前尚無針對NAFLD的特異性藥物，傳統(tǒng)的他汀類、雙胍類及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等僅作為NAFLD降脂、改善胰島素抵抗及合并高血壓時的治療；法尼醇受體激動劑具有潛在的調(diào)節(jié)脂代謝的作用，但由于副作用明顯，尚不推薦用于NAFLD的治療，因此，中藥在改善NAFLD的作用方面受到越來越多的關(guān)注[5-6]。

肝爽顆粒(Ganshuang granule, GSG)是中藥復(fù)方制劑，主要成分有丹參、柴胡(醋制)、白芍、當(dāng)歸、茯苓等13味中藥,具有疏肝健脾、保肝護(hù)肝等功效，臨床主要用于治療急慢性肝炎、肝硬化[7]。并且對慢性病毒性肝炎、CCl4引起的肝損傷等有一定治療作用[8-9]。GSG中的柚皮苷還有抗纖維化的作用[10]。前期研究[7,11]表明，GSG能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂質(zhì)代謝紊亂及肝脂肪變性，減輕氧化應(yīng)激水平，但該研究未涉及具體機(jī)制。本研究通過體外建立新型3D組織工程(tissue engineering, TE)肝臟NAFLD模型，探索GSG對NAFLD的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自上海Hyclone公司; 胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購自美國Gibco公司; PCR提取試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)。GSG浸膏由保定步長天浩制藥有限公司提供。蠕動泵購自MasterFlex、0.22 μm濾器(millex-GV)、SDC購自VETEC、一次性靜脈留置針(泰爾茂Hybria ⅡB型三通)、油酸、棕櫚酸購自Sigma公司、CCK8試劑盒購自DOJINDO公司、油紅O染色試劑盒購自Solarbio公司、TG試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠12只(體質(zhì)量180～220 g)來自維通利華實驗動物中心，實驗前動物正常飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 TE肝臟纖維支架的制備 大鼠用10%水合氯醛麻醉，75%酒精消毒腹部，打開腹腔，暴露肝臟及門靜脈。用一次性靜脈留置針插入門靜脈，作為肝血管系統(tǒng)的灌注入口。用1%脫氧膽酸鈉(1%SDC)緩沖液(內(nèi)含20 UL/L磷脂酶A2)通過導(dǎo)管灌流肝臟，將肝臟脫細(xì)胞，隨后用生理鹽水沖洗灌流直到組織變透明。此時得到了脫細(xì)胞并保留有全部細(xì)胞外基質(zhì)成分的肝臟支架模型。隨后將大鼠透明的肝臟支架模型分離下來，結(jié)扎、修剪并保留部分肝葉，懸掛于事先裝好DMEM的無菌異形瓶內(nèi)，連接蠕動泵裝置，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中循環(huán)灌流過夜。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型再細(xì)胞化 將HepG2 細(xì)胞(購自ATCC)在DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)中正常培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。再細(xì)胞化前將HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分3次注入循環(huán)灌流裝置，每次細(xì)胞數(shù)量為1×107，并以8 ml/min的速度循環(huán)灌流。在此期間，HepG2細(xì)胞重新進(jìn)入肝臟支架并進(jìn)行增殖。24 h后，分別灌注正常的完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)和高脂培養(yǎng)基(含1 mmol/L FFA的完全培養(yǎng)基)建立TE肝(正常對照組，n=4)和TE脂肪肝(TE fatty，TEF)模型(FFA組，n=4)。5 d后GSG浸膏(濃度10 μg/ml)干預(yù)TEF(FFA+GSG組，n=4)，第8天收集標(biāo)本(圖1)。

1.2.3 高脂培養(yǎng)基配制 將1 mol/L油酸和棕櫚酸按2∶1比例混合，加入10 μl NaOH和800 μl DMEM混合并置于60 ℃的超聲水浴中震蕩30 min。加入3.1 ml 2%牛血清白蛋白，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4。將制備好的FFA加入到100 ml完全培養(yǎng)基中，制成高脂培養(yǎng)基。

1.2.4 細(xì)胞毒性檢測Cell Counting Kit 8(CCK8) 將HepG2細(xì)胞制成40～60個/μl的細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板加入不同濃度的GSG浸膏，作用24 h后根據(jù)試劑說明書要求，向每孔加入10 μl CCK溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵20 min，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)，并計算細(xì)胞增殖-毒性。

1.2.5 油紅O染色 將組織的冰凍切片用60%異丙醇洗滌20～30 s，然后在改良油紅O染色液染色15 min。再用60%異丙醇及dH2O洗滌，去除非特定結(jié)合的染色。最后用蘇木精染核，并用Olympus BX51+DP72顯微鏡拍照。

1.2.6 RNA提取和RT-qPCR 用Trizol提取總RNA，稀釋后紫外分光光度計，計算RNA濃度，然后用DNase處理。使用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄后在ABI StepOnePlus機(jī)器上運行qPCR,所用引物見表1。數(shù)據(jù)收集使用ABI7500軟件，結(jié)果顯示以2ΔΔct形式體現(xiàn)，并用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 目的基因及內(nèi)參GAPDH引物

1.2.7 TG的測定 將從肝臟模型中消化下來的HepG2細(xì)胞用PBS沖洗干凈，并按照試劑盒(TG測定試劑盒，A110-1，南京建城)說明書進(jìn)行處理。然后，將2.5 μl細(xì)胞勻漿加入96孔板中，與250 μl工作溶液混合，37 ℃孵育10 min。在510 nm處測量OD值，并計算TG濃度。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由北京佑安醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(批號：AEEI-2020-076)，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 TEF模型的建立 再細(xì)胞化后的TE肝臟在孵箱中用蠕動泵持續(xù)灌注(圖2)。正常對照組TE肝臟一直用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。8 d后，F(xiàn)FA組肝臟與正常對照相比，有眾多肉眼可見的脂肪聚積(圖3)，并且其細(xì)胞內(nèi)TG含量為正常對照組的2倍(t=4.842，P=0.004 7)，同時胰島素抵抗指標(biāo)丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)mRNA水平也顯著升高(t=2.784，P=0.031 8)(圖4)，表明NAFLD模型制備成功。

2.2 GSG的細(xì)胞毒性和降脂效果檢測 用普通平面的細(xì)胞培養(yǎng)方法首先檢測了GSG浸膏的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)從0.01 ng/ml～1 mg/ml，GSG浸膏均無明顯的細(xì)胞毒性，安全性良好(圖5a)。進(jìn)一步觀察了不同濃度下GSG的降脂效果，發(fā)現(xiàn)從100 μg/ml開始其降脂能力呈劑量依賴性，100 ng/ml之后降脂效果不明顯，選取10 μg/ml作為實驗用藥物濃度(圖5b)。

2.3 GSG對脂肪肝細(xì)胞胞內(nèi)TG水平和胰島素抵抗水平的影響 油紅O染色結(jié)果顯示，F(xiàn)FA組肝細(xì)胞內(nèi)有大量的中性脂肪滴，在GSG干預(yù)后脂肪滴明顯減少(圖6a)。通過對TG的定量檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA+GSG組肝細(xì)胞內(nèi)TG水平較FFA組下降66%(t=0.055，P=0.003 7)(圖6b)。PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)FA+GSG組肝細(xì)胞胰島素抵抗指標(biāo)PDK4水平也下降了61%(t=3.761，P=0.009 4)(圖6c)。

2.4 GSG對肝臟脂質(zhì)合成途徑相關(guān)酶的影響 正常生理狀態(tài)下,肝細(xì)胞合成TG主要有2個來源[11]:攝取脂肪組織釋放至外周循環(huán)中的FFA,酯化生成TG；以葡萄糖氧化產(chǎn)物乙酰輔酶A為原料從頭合成脂肪酸,酯化生成TG(圖7)。其中前者是肝細(xì)胞TG的主要來源。本研究檢測了上述兩種來源途徑中的多種合成酶類如圖8所示，GSG干預(yù)后其肝細(xì)胞的脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)(t=6.552，P=0.007 2)和脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)mRNA水平(t=4.944，P=0.001 1)顯著降低；參與TG從頭合成的各種酶的表達(dá)也顯著下降，包括ACLY(t=2.689，P=0.027 6)、ACC(t=4.524，P=0.020 2)、FAS(t=6.040，P=0.009 1)、FADS2(t=3.758，P=0.005 6)和APGAT5(t=4.443，P=0.047 1)。ApoB mRNA水平也顯著下降(t=3.032，P=0.016 3)。

3 討論

NAFLD是臨床常見肝臟疾病, 好發(fā)于糖尿病、肥胖患者[12]。長期高脂飲食導(dǎo)致肝臟脂肪攝入過多,肝臟脂肪超載引起代謝障礙, 未經(jīng)氧化的脂質(zhì)在肝細(xì)胞沉積、變性。此外，代謝性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡等也參與NAFLD病變[13-14]?，F(xiàn)實中難以對患者反復(fù)行肝臟活檢，因此需要能密切反映人類NAFLD的模型進(jìn)行相關(guān)研究[15]。筆者團(tuán)隊Wu[16]等前期創(chuàng)新性地構(gòu)建了3D TE脂肪肝模型，該模型被證實與NAFLD患者早期的許多臨床表現(xiàn)相似，包括高度的胰島素抵抗、TG沉積、細(xì)胞色素酶的變化、白蛋白和尿素氮合成增加。由于模型采用人的肝細(xì)胞，因此種屬差異性小，是一種良好的NAFLD細(xì)胞模型[17-18]。

脂代謝紊亂是NAFLD的主要致病機(jī)制之一：肝臟攝取及合成的脂肪酸超過其β氧化及排出能力(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與apoB 組裝成VLDL排泌到竇周隙)，導(dǎo)致脂代謝平衡打破，輸入大于輸出，過多的TG蓄積在肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂質(zhì)過度沉積[19]。肝細(xì)胞膜上的脂肪CD36介導(dǎo)FFA跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運，F(xiàn)FA一旦進(jìn)入胞質(zhì)，便與細(xì)胞內(nèi)的“擺渡車”-FABP家族緊密結(jié)合，運送到TG代謝部位[20]，被脂酰CoA合成酶激活形成?；o酶A。本研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝模型的CD36表達(dá)明顯增高，而GSG干預(yù)后其表達(dá)下調(diào)，表明GSG可通過降低FFA的攝取途徑減少TG合成。ACC催化細(xì)胞漿內(nèi)脂肪酸從頭合成時乙酰輔酶A向丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，是脂質(zhì)從頭合成途徑的限速酶。研究[21]表明，特異性敲除小鼠肝細(xì)胞ACC,其胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量為野生型小鼠的30%,TG含量僅為野生型小鼠的一半,且脂肪酸β氧化不受影響,表明ACC的缺失可以下調(diào)脂肪酸從頭合成。而FAS催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化棕櫚酰輔酶A。有研究[22]表明，脂肪肝時FAS的mRNA、蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào)。筆者團(tuán)隊先前的研究[16]與上述情況相一致，NAFLD模型ACC、FAS mRNA水平較TE肝模型顯著升高。本實驗發(fā)現(xiàn)GSG處理后可明顯下調(diào)脂肪肝細(xì)胞的ACC和FAS表達(dá)，表明GSG也可以通過減少脂質(zhì)從頭合成來減少TG合成。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后ApoB mRNA水平也顯著下降，原因可能是TG的兩條來源途徑均被削弱，因此TG含量減少，相應(yīng)地內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行裝配時對ApoB的需求減少，因此表達(dá)下降。另一方面，可能與GSG減少胰島素抵抗，從而減少VLDL和乳糜微粒的裝配和分泌有關(guān)[23]。

胰島素抵抗及隨之相應(yīng)的高胰島素血癥在NAFLD時肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積中也起著重要作用[24]:一方面, 胰島素抵抗增強(qiáng)外周脂肪組織TG降解, 抑制FFA酯化, 升高FFA水平, 使肝臟攝取FFA增多; 胰島素抵抗導(dǎo)致線粒體TG轉(zhuǎn)運蛋白受損, ApoB與TG 結(jié)合能力下降[25]。另一方面, 胰島素抵抗伴隨的高胰島素血癥增加肝細(xì)胞合成脂肪酸, 并抑制其β氧化, 造成肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；高胰島素血癥還過氧化物酶體增生物激活受體α上調(diào)相關(guān)脂肪酶的表達(dá)。在本研究中，使用GSG浸膏可使PDK4水平顯著下降，說明胰島素抵抗改善，肝臟攝取FFA減少，脂質(zhì)蓄積減少，ApoB與TG 結(jié)合能力升高。

綜上所述，本研究表明GSG有明顯的降脂作用，其機(jī)制可能為GSG通過減少FFA的攝取及脂質(zhì)的從頭合成來減少TG的合成，從而減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善脂肪肝的脂代謝，改善胰島素抵抗，有望為臨床NAFLD的治療提供新的思路。