萊蕪黑豬肉中煙酸含量的測定

曹 峰 耿冬青 周志杰

濟南市第二食品藥品檢驗檢測中心 山東濟南 271100

萊蕪黑豬(萊蕪豬)是我國優(yōu)良的地方品種，2006年被農業(yè)部列為國家級畜禽遺傳資源保護品種，具有肉質細嫩多汁、香味濃郁等優(yōu)良特性[1]。萊蕪黑豬肉營養(yǎng)豐富，肌內脂肪含量、肌肉鮮味氨基酸、必需氨基酸等均高于普通豬肉[2]，此外黑豬肉中的維生素含量較高，尤以煙酸較多。煙酸(Nicotinic acid)也稱維生素B3、尼克酸，是人體必需的13種維生素之一。煙酸在人體內可轉化為煙酰胺，參與體內脂質代謝，組織呼吸的氧化過程[3]。煙酸還具有抑制動脈粥樣硬化[4]，保護人臍內皮細胞，維護血管結構及功能等作用[5]。人體若缺乏煙酸，可產生糙皮病。此外，煙酸常添加在豬肉等肉類產品中，以保持肉的色澤鮮艷，然而攝入過量的煙酸會引起充血癥，如臉紅，皮膚騷癢，頭痛等癥狀[6]。因此，準確快速測定煙酸含量對提高萊蕪黑豬肉的品質及確保食品安全具有重要意義。

目前煙酸的檢測方法有高效液相色譜法[7]、微生物法[8]、紫外分光光度法[9]、毛細管電泳法[10]，超臨界流體色譜法[11]等，其中高效液相色譜法是較常用的方法，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。測定食品中煙酸的前處理方法多采用酸水解法[3,6]，由于黑豬肉水解后將產生大量的水溶性蛋白，這些蛋白進入色譜柱后，很難被洗脫下來，不但影響分析效果，還會縮短色譜柱的使用壽命[12]。針對此問題，本文參照相關研究[13]并加以改進，采用20%甲醇水溶液作為提取液，經超聲提取，較好地解決了這一問題，大大降低了對色譜柱的損害，并對高效液相色譜法進行了改進優(yōu)化，可以簡單、快速、精確測定萊蕪黑豬肉中的煙酸含量。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

Ultimate3000高效液相色譜儀(配紫外/可見光檢測器)，美國賽默飛世爾科技有限公司；

TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器股份有限公司；

KQ-800KED高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；

2-16KL高速冷凍離心機，德國SIGMA公司。

1.1.2 實驗試劑

煙酸標準物質(質量分數(shù)≥99%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇(色譜純)，默克股份兩合公司；

磷酸二氫鉀(優(yōu)級純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(150×4.6mm，5.0μm)。

流動相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(5∶95，V/V)。

流速：1mL/min。

柱溫：30℃。

紫外檢測器波長：261nm，進樣量20μL。

1.3 樣品處理

稱取20g萊蕪黑豬肉(瘦肉)樣品，放于均質器中并加入20%甲醇溶液20mL，研磨成漿并混合均勻，然后稱取2g(精確至0.001g)勻漿試樣至50mL塑料離心管中，加入20mL20%甲醇，渦旋混勻后放入超聲波清洗器中超聲提取60min，再以6 000r/min離心15min，將全部上清液移入容量瓶中，用20%甲醇定容至50mL，經0.22μm有機相濾膜過濾后待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 紫外檢測器波長的選擇

將煙酸標準溶液用紫外分光光度計進行光譜掃描，以確定煙酸的最大吸收波長，結果見圖1所示。

掃描光譜圖可以顯示煙酸在波長261nm處有最大吸收，與國標方法[14]相同，為保證該方法的靈敏度及穩(wěn)定性，選擇261nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

本研究在流動相組成及比例不同的條件下，根據(jù)保留時間與色譜峰分離情況等，來確定適合的流動相組成及比例。參照相關文獻[14～19]，本研究同時驗證了甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液、甲醇-異丙醇-庚烷磺酸鈉、甲醇-0.004mol/L庚烷磺酸鈉-冰醋酸、乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液4種不同流動相體系，結果表明以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液為流動相時目標峰與雜質峰能很好分離，由于甲醇毒性較小，因此選用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液作為流動相。

將甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液分別在體積比為5∶95、10∶90及15∶85的條件下對煙酸標準品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)在體積比為5∶95時煙酸出峰時間為3min左右，煙酸色譜峰峰形好，且能與雜質峰完全分離，甲醇的體積比提高到10%及15%后，煙酸色譜峰的保留時間縮短，但與雜質峰無法完全分離，因此本研究選擇甲醇與0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液的比例為5∶95(V/V)。

2.1.3 色譜柱柱溫的確定

色譜柱的分離效果受柱溫影響較為顯著，溫度升高，柱壓下降，保留時間縮短。由于煙酸比較耐熱[3]，是理化性質最穩(wěn)定的一種維生素[19]，為提高檢測精密度，縮短分析時間，柱溫選擇30℃。

2.1.4 煙酸標準物質及萊蕪黑豬肉色譜圖

根據(jù)以上實驗分析確定的色譜條件，煙酸標準物質溶液及萊蕪黑豬肉樣品色譜圖見圖2、圖3。

2.2 煙酸的線性和檢出限

將煙酸標準物質儲備液逐級稀釋，配制成6個不同濃度標準品溶液并在優(yōu)化的色譜條件進行測定，得到煙酸的標準曲線回歸方程為：Y=37 900X+6 550(Y，峰面積；X，濃度)，相關系數(shù)R=0.9998，曲線的RSD為1.67%，結果表明煙酸在1.0～25.0mg/L范圍內濃度和峰面積線性關系良好，在此條件下煙酸的檢出限(以信噪比為3∶1時煙酸標準物質溶液的濃度為本方法檢出限)為2.0×10-4g/kg，標準曲線見圖4。

2.3 精密度實驗

萊蕪黑豬肉樣品按1.3方法處理后，在優(yōu)化的色譜條件下對黑豬肉樣品平行測定6次，計算樣品的標準偏差及相對標準偏差，結果見表1。

表1 精密度實驗結果(n=6)

從表1可以看出，連續(xù)6次平行測定的萊蕪黑豬肉樣品中煙酸含量，其相對標準偏差(RSD)為0.62%，表明該方法精密度良好，滿足要求。

2.4 樣品加標回收率的測定

稱取適量黑豬肉樣品，分別加入0.50、1.00、5.00、10.00、20.00mg/L的煙酸標準物質，依照1.3所述將樣品處理，測定6次，結果見表2。

表2 加標回收結果(n=6)

表中結果顯示，在1.2的測試條件下黑豬肉中煙酸的加標回收率為96.5%～103.8%，平均加標回收率為98.4%，回收率的RSD為2.76%，測定結果準確可靠。

3 結論

本方法以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(5∶95，V/V)為流動相，采用紫外檢測器，波長為261nm，煙酸在1.0～25.0mg/L范圍內有良好的線性關系(R=0.9998)，精密度實驗表明其相對標準偏差為0.62%(n=6)，平均加標回收率為98.4%，檢出限為2.0×10-4g/kg，萊蕪黑豬肉樣品中煙酸的平均含量為6.21mg/100g，結果顯示該方法可準確快速測定萊蕪黑豬肉等肉品中的煙酸含量。