低溫脅迫對(duì)不同雜交水稻組合苗期耐冷性及生理生化指標(biāo)的影響

沈航 陳嬌 黎佰楊

摘要：為明確雜交水稻萌發(fā)率、苗期耐冷性與耐冷性指標(biāo)的關(guān)系，以重慶師范大學(xué)10個(gè)自育雜交水稻組合和糯稻89-1為材料，測(cè)定種子的生理指標(biāo)、低溫萌發(fā)率及苗期低溫處理恢復(fù)生長(zhǎng)后的死苗率。不同雜交水稻組合的可溶性糖含量、維生素C含量、過氧化氫酶活性差異明顯，種子自身所含這4種物質(zhì)與水稻低溫下的萌發(fā)率可能具有一定關(guān)系;種子萌發(fā)對(duì)溫度變化較敏感，每個(gè)組合中溫度為6 ℃處理?xiàng)l件下種子萌發(fā)率均高于11 ℃，初步推斷臨界點(diǎn)以下低溫層積對(duì)水稻種子的萌發(fā)有積極作用;試驗(yàn)結(jié)果表明，不同低溫條件處理下水稻苗期死亡率有明顯差異，溫度越低，水稻幼苗受害越大，復(fù)溫后死亡率越高;聚類分析將雜交組合分為A、B、C 3類，A組、B組生理指標(biāo)大部分都高于C組，低溫萌發(fā)不同雜交水稻組合內(nèi)變異系數(shù)較大。總的來說，水稻種子耐冷指標(biāo)對(duì)萌發(fā)率可能具有一定作用，在苗期，水稻對(duì)低溫較敏感，隨著時(shí)間和溫度增長(zhǎng)受影響越大，根據(jù)耐冷指標(biāo)、萌發(fā)率、死苗率對(duì)不同水稻雜交組合進(jìn)行分類，研究結(jié)果可以為選育耐冷性水稻品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：糯稻89-1;雜交水稻;幼苗;耐冷;低溫脅迫、萌發(fā)率

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物之一，與國(guó)家糧食安全密切相關(guān)[1]。水稻種植常受氣溫影響，一般每4～5年就發(fā)生1次較大規(guī)模的低溫冷害[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有24個(gè)國(guó)家、1 500萬hm2以上的稻作面積時(shí)常受到低溫威脅，使水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，低溫冷害儼然已成為全球性自然災(zāi)害[3-6]。日本最早于20世紀(jì)30年代開始水稻的耐冷性研究[7]，至今已有70多年的歷史，我國(guó)從20世紀(jì)70—80年代開始水稻耐冷性研究[8]，如今，國(guó)內(nèi)外對(duì)于水稻的耐冷性研究已取得較好的進(jìn)展，在耐冷性基因定位克隆、耐冷生理生化和分子機(jī)制等方面都有很大的進(jìn)展。

研究水稻耐冷性的目的在于培育出耐冷性強(qiáng)的水稻品種，以減輕低溫冷害對(duì)水稻的傷害。水稻耐冷性研究雖然取得了很多的成果，但選育出的耐冷性強(qiáng)的水稻品種卻較少[9]。糯稻89-1是耐冷性極強(qiáng)的材料，其芽期、幼苗期的耐冷性均達(dá)到一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]。糯稻89-1能通過腋芽休眠越過冬季，次年萌發(fā)再生，越冬再生季產(chǎn)量達(dá)6 291 kg/hm2，與正季相當(dāng)[11]，糯稻89-1是用于研究水稻耐低溫的珍稀材料。本研究以糯稻89-1為親本與多個(gè)品種（系）進(jìn)行雜交，對(duì)不同雜交組合后代的低溫萌發(fā)以及苗期的耐冷性進(jìn)行分析，以期為耐冷性水稻材料的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以重慶師范大學(xué)自育的10個(gè)雜交水稻組合、糯稻89-1為材料（表1）。試驗(yàn)在重慶師范大學(xué)水稻育種基地進(jìn)行，于2017年3月播種，8月收集種子，保存3個(gè)月后進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定和不同溫度下的萌發(fā)試驗(yàn)。所配組合中糯稻89-1為一級(jí)耐冷性品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子生理指標(biāo)的測(cè)定 精選飽滿的籽粒進(jìn)行測(cè)定。各組合分別做3次重復(fù)，取平均值。可溶性糖（SS）含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[12];過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法[13];丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法[12];維生素C含量的測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法[14]。

1.2.2 種子萌發(fā)率 選取飽滿的籽粒經(jīng)常規(guī)方法消毒后，置于培養(yǎng)皿中。先用蒸餾水侵泡10 min后，去除半飽滿籽粒。用3%的次氯酸侵泡30 min后，用去離子水沖洗干凈并均勻平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，放置于不同溫度下培養(yǎng)，其間每天定時(shí)換水并保持培養(yǎng)皿濕潤(rùn)。設(shè)置的溫度分別為6、11、16、27 ℃，12 d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，各組合3次重復(fù)，取平均值。12 d 后，將6、11 ℃條件下未萌發(fā)的水稻種子轉(zhuǎn)入27 ℃條件下繼續(xù)萌發(fā)，12 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.3 苗期耐冷性鑒定 取不同雜交水稻組合種子100粒，滅菌后置于27 ℃條件下，在0.8%瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，留50株長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗移至溫度為6、11、16 ℃條件下培養(yǎng)12 d后測(cè)量苗高、根長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)死亡率，12 d后，將溫度為6、11 ℃條件下的水稻幼苗移至27 ℃條件下恢復(fù)生長(zhǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)死苗率。3次重復(fù)，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)和繪制圖表，用SPSS 22.0進(jìn)行平均值、單因素方差、相關(guān)性及聚類分析，聚類選用Ward法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交水稻組合生理指標(biāo)比較

10個(gè)供試雜交水稻組合不同生理生化指標(biāo)差異明顯，MDA含量的差異性最大，CAT活性差異性最小。其中，維生素C含量變化范圍為6.325～10.983 mg/100 g（圖1-A）;可溶性糖含量變化范圍為20.73%～36.52%，平均值為26.84%（圖1-B）;過氧化氫酶活性變化范圍為58.9～92.8 H2O2 mg/（g·min）（圖1-C）;丙二醛含量變化范圍為0.016 4～0.250 4 μmol/g（圖1-D）。726雜交水稻組合各項(xiàng)指標(biāo)均低于平均值，MDA含量比平均值降低726.59%。

2.2 不同溫度條件下不同雜交水稻組合種子萌發(fā)率比較

為明確種子耐冷性生理指標(biāo)對(duì)萌發(fā)率的影響，對(duì)10個(gè)不同雜交水稻組合進(jìn)行不同溫度下種子萌發(fā)試驗(yàn)。恒溫萌發(fā)條件下，溫度為27 ℃時(shí)萌發(fā)率為96.67%，溫度為16 ℃時(shí)種子雖能萌發(fā)，但萌發(fā)率均低于23%（圖2）。變溫萌發(fā)中，溫度為6、11 ℃的條件下培養(yǎng)種子12 d后萌發(fā)率仍為0，繼轉(zhuǎn)入溫度為27 ℃萌發(fā)，培養(yǎng)1 d后開始露白;6 ℃轉(zhuǎn)至27 ℃的平均萌發(fā)率為91.29%，11 ℃轉(zhuǎn)至27 ℃的平均萌發(fā)率為84.48%。每個(gè)組合中6 ℃處理過的種子萌發(fā)率均高于11 ℃。但6 ℃轉(zhuǎn)至27 ℃萌發(fā)率低于27 ℃條件下的萌發(fā)率，可能是因?yàn)榈蜏叵绿幚淼臅r(shí)間過長(zhǎng)。不同低溫處理對(duì)轉(zhuǎn)溫后不同雜交水稻組合種子萌發(fā)率的影響有所差異，其中對(duì)C23、702、730的雜交水稻組合影響最大，但對(duì)726雜交水稻組合影響較小。且726在不同溫度條件下的萌發(fā)率均為最低，與耐冷性生理指標(biāo)相對(duì)應(yīng)（圖3）。

糯稻89-1/CDR22與川農(nóng)1A、Ⅱ-32A、宜香1A雜交組合歸為A組，糯稻89-1/桂99與中9A、科2A、巴1A 3個(gè)不育系所配同父異母組合歸為B組。4個(gè)不同恢復(fù)系與岡46A不育系所配同母異父雜交組合歸為C組。A組、B組維生素C含量、可溶性糖含量、過氧化氫酶活性平均值均高于C組，溫度為27 ℃條件下種子萌發(fā)率是低溫（16℃）條件下的5倍以上，低溫萌發(fā)不同組合內(nèi)的變異系數(shù)較大。變溫下，溫度為6 ℃處理的種子萌發(fā)率均大于 11 ℃，表明不同的低溫處理對(duì)種子萌發(fā)有明顯的影響（表2）。

2.3 低溫脅迫對(duì)水稻幼苗及恢復(fù)生長(zhǎng)的影響

從圖4可以看出，低溫處理下，水稻幼苗普遍生長(zhǎng)緩慢或接近停滯，并出現(xiàn)干枯腐爛的現(xiàn)象，且不同低溫脅迫對(duì)幼苗的影響差異明顯。溫度為16 ℃條件下，不同水稻雜交組合幼苗均能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度較27 ℃慢，培養(yǎng)3 d后，C9、C2雜交組合葉尖開始出現(xiàn)變黃跡象，繼續(xù)培養(yǎng) 9 d 后發(fā)現(xiàn)不同水稻雜交組合葉尖均有不同程度的變黃，730、702、C37、C9雜交組合葉尖變黃程度嚴(yán)重，由葉尖變黃轉(zhuǎn)為整葉變黃，最大變黃長(zhǎng)度達(dá)3.3 cm，而糯 89-1 及726、714、C14雜交組合生長(zhǎng)狀態(tài)良好，葉尖變黃株數(shù)少。溫度為6、11 ℃低溫處理下，不同組合后代死苗率差異較大，糯89-1和714在2個(gè)溫度條件下死苗率均為0，溫度為11 ℃條件下幼苗死亡率普遍高于6 ℃ 條件下。27 ℃恢復(fù)生長(zhǎng)7 d后，濕度為6 ℃處理的幼苗死亡率明顯高于11 ℃處理的幼苗，且除糯89-1外的幼苗經(jīng)過恢復(fù)生長(zhǎng)期幾乎全部死亡，C23、714雜交水稻組合由0上升至100%。C9、726、702雜交水稻組合幼苗死亡率相對(duì)較低，分別為84.00%、84.16%、77.86%。濕度為11 ℃處理下的幼苗死亡率雖然較恢復(fù)生長(zhǎng)前有不同程度的增加，但大多數(shù)組合能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，其中C2、714雜交水稻組合幼苗死亡率較低，分別為4.05%、6.25%。

3 討論與結(jié)論

植物種子播種后能否正常萌發(fā)是不同的內(nèi)源性和環(huán)境因素相互作用，共同調(diào)節(jié)種子休眠與萌發(fā)之間的平衡的結(jié)果[9，15-16]。10個(gè)水稻雜交組合可溶性糖含量、維生素C含量、過氧化氫酶活性差異明顯，這與不同水稻雜交組合遺傳物質(zhì)的差異有關(guān)。3個(gè)指標(biāo)與種子低溫下萌發(fā)率以及低溫處理后恢復(fù)正常溫度下的萌發(fā)率具有相關(guān)性，可能是種子可溶性糖含量、維生素C含量、過氧化氫酶活性與低溫下種子的萌發(fā)率有關(guān)，本試驗(yàn)的結(jié)果與張啟雷等的研究結(jié)論[17]相同。

種子萌發(fā)對(duì)溫度的變化較敏感，低溫是種子萌發(fā)的脅迫因素之一[18]。低溫環(huán)境下，水稻種子萌發(fā)率會(huì)降低，其降低程度與種子耐低溫能力有關(guān)。本研究中6、11 ℃低溫條件下，不同水稻雜交組合萌發(fā)率均為0，說明該溫度抑制了種子的萌發(fā)。溫度為16 ℃時(shí)不同水稻雜交組合種子均有萌發(fā)，但萌發(fā)率普遍較低，糯89-1在16 ℃萌發(fā)12 d萌發(fā)率仍然能達(dá)到78%，說明低溫耐性強(qiáng)，這與趙正武等的研究結(jié)果[18]具有一致性。本研究中，不同水稻雜交組合種子在不同溫度處理后，恢復(fù)正常溫度萌發(fā)時(shí)其萌發(fā)率均具有明顯差異，初步推斷種子萌發(fā)階段，低溫脅迫的強(qiáng)度對(duì)于脅迫后水稻種子活力的恢復(fù)有重要的影響。不同水稻雜交組合的種子在經(jīng)過6、11 ℃ 低溫處理后，其萌發(fā)率仍保持在74.07%～96.39%之間，大部分甚至高于優(yōu)良親本糯 89-1，其中涉及的潛在育種可利用潛力以及對(duì)深入研究種子經(jīng)歷低溫后萌發(fā)的生理機(jī)制和遺傳效應(yīng)都具有重要的利用價(jià)值。當(dāng)溫度低于12 ℃時(shí)，遭遇中等倒春寒（日平均氣溫≤12.0 ℃ 4～6 d或日平均氣溫≤14.0 ℃ 7～10 d）甚至是強(qiáng)倒春寒（日平均氣溫≤12.0 ℃≥7 d或日平均氣溫≤14.0 ℃≥11 d）時(shí)，種子不能萌發(fā)，度過倒春寒后，氣溫回暖，種子活力基本恢復(fù)，方可繼續(xù)萌發(fā);除種子萌發(fā)受低溫影響外，低溫還會(huì)抑制幼苗的生長(zhǎng)，使幼苗出現(xiàn)葉尖變黃、生長(zhǎng)緩慢或存活率單向減少等現(xiàn)象[19-20]。低溫引起植株葉片形態(tài)的變化是植物對(duì)冷害最直觀的反映，主要包括葉片卷曲、萎縮、葉色褐化，甚至干枯死亡[21]。本研究中，溫度在6 ℃條件下，幼苗幾乎不生長(zhǎng)，并且葉片失綠變黃干枯。轉(zhuǎn)入27 ℃恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，在溫度為6 ℃條件下脅迫12 d的幼苗幾乎全部生長(zhǎng)霉菌死亡，溫度為11 ℃條件下大部分組合能度過恢復(fù)生長(zhǎng)期，正常生長(zhǎng)，低溫脅迫嚴(yán)重影響幼苗生長(zhǎng)，脅迫期間溫度越低，對(duì)幼苗造成的傷害越大，在恢復(fù)生長(zhǎng)期死亡率越高。此外，水稻雜交組合702盡管在冷害時(shí)出現(xiàn)整株枯黃的現(xiàn)象但在溫度為27 ℃復(fù)育后死亡率最低，這可能與越冬再生的性狀有關(guān)。

聚類分析的結(jié)果表明，10個(gè)水稻雜交組合的低溫耐受性與糯89-1差異較大。水稻雜交組合C2、C9、C14以及C23、C27、C37為同父異母組合，714、726、730為同母異父組合，這9個(gè)組合并未按同父異母或是同母異父的組配方式聚為一類，各組合低溫耐受性差異不大，說明苗期的耐冷性不存在細(xì)胞質(zhì)遺傳，而是受細(xì)胞核基因控制的，劉建豐等研究發(fā)現(xiàn)，雜交稻F1苗期耐冷性傾向于母本，受父本影響較小[22-23]，出現(xiàn)不同結(jié)果可能是由于試驗(yàn)所利用的低溫處理?xiàng)l件和耐冷性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及試驗(yàn)材料耐冷性程度不同。另外，除了702，其他9個(gè)組合均有糯89-1血緣，這9個(gè)雜交組合的苗期耐冷性與702相差不大，表明糯89-1耐冷性的遺傳力較低，這與金潤(rùn)洲對(duì)耐冷性遺傳研究的結(jié)果[24]相反，可能是所用材料的不同導(dǎo)致的。

水稻種子在低溫脅迫下的萌發(fā)率很大程度上由自身生理物質(zhì)含量的高低決定，而丙二醛含量、可溶性糖含量、維生素C含量、過氧化氫酶活性高低對(duì)水稻種子在低溫脅迫下種子的萌發(fā)情況可能起到關(guān)鍵作用。水稻在苗期遇到冷害會(huì)影響秧苗的發(fā)育，不同雜交組合受到低溫影響的表現(xiàn)基本相同，這與潘孝武等的試驗(yàn)結(jié)果[25]基本一致。本研究主要致力于挖掘以糯稻89-1為主要親本的不同雜交水稻組合的耐冷生理指標(biāo)與萌發(fā)率和苗期耐冷能力的關(guān)系，在涉及到糯稻89-1耐冷性狀遺傳方面還須進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧興旺，王海洋，唐曉艷，等. 雜交水稻育種將迎來新時(shí)代[J]. 中國(guó)科學(xué)（生命科學(xué)），2013，43（10）：864-868.

[2]高益波，景元書，劉明璐，等. 抽穗揚(yáng)花期低溫強(qiáng)度對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響與模擬[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（5）：53-57.

[3]Sthapit B R，Witcombe J R. Inheritance of tolerance to chilling stress in rice during germination and plumule greening[J]. Crop Science，1998，38（3）：660-665.

[4]王士強(qiáng)，趙海紅，趙黎明，等. 水稻冷害生理功能變化與調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（36）：1-6.

[5]王主玉，申雙和. 水稻低溫冷害研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11971-11973.

[6]崔 迪，楊春剛，湯翠鳳，等. 低溫脅迫下粳稻選育品種耐冷性狀的鑒定評(píng)價(jià)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13（5）：739-747.

[7]Nishiyama I. Proceedings of the symposium on climate and rice[M]. Manila：IRRI，1976：159-185.

[8]韓龍植，張三元. 水稻耐冷性鑒定評(píng)價(jià)方法[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（1）：75-80.

[9]王尚明，賀浩華，肖葉青，等. 水稻東野1號(hào)苗期耐冷性遺傳分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（1）：1-4.

[10]王春萍，雷開榮，李正國(guó)，等. 低溫脅迫對(duì)水稻幼苗不同葉齡葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，21（3）：38-43.

[11]趙正武，李仕貴，雷樹凡. 糯稻89-1越冬性遺傳研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（12）：2399-2405.

[12]趙世杰，史國(guó)安，董新純. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1998：136-139.

[13]湯紹虎，羅 充. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 重慶：西南師范大學(xué)出版社，2012.

[14]孫 群，胡景江. 植物生理學(xué)研究技術(shù)[M]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2006.

[15]簡(jiǎn)水溶，萬 勇，羅向東，等. 東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷性的遺傳分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2011，46（1）：21-27.

[16]Shu K，Meng Y J，Shuai H W，et al. Dormancy and germination：how does the crop seed decide？[J]. Plant Biology，2015，17（6）：1104-1112.

[17]張啟雷，劉 強(qiáng)，高 輝，等. 內(nèi)源抗壞血酸對(duì)水稻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2016，24（3）：273-279.

[18]趙正武，王述民，李世平. 珍稀稻種資源越冬糯稻89-1研究初報(bào)[J]. 雜交水稻，2000，15（3）：3.

[19]李太貴，王 磊. 低溫下水稻幼苗形態(tài)生理應(yīng)變研究[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，1996，15（6）：61-63，50.

[20]Mahajan S，Tuteja N. Cold，salinity and drought stresses：an overview[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，444（2）：139-158.

[21]許 英，陳建華，朱愛國(guó)，等. 低溫脅迫下植物響應(yīng)機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2015，37（1）：40-49.

[22]劉建豐，陳立云. 水稻耐冷性研究現(xiàn)狀與展望[J]. 作物研究，1996，10（2）：42- 44.

[23]李 平，劉鴻先，王以柔，等. 低溫對(duì)雜交水稻及其親本三系始穗期旗葉光合作用的影響[J]. 植物學(xué)報(bào)，1990，32（6）：456-464.

[24]金潤(rùn)洲. 日本關(guān)于水稻耐冷性鑒定及其遺傳的研究[J]. 水稻文摘，1990，9（3）：1-5.

[25]潘孝武，李小湘，黎用朝，等. 湖南早秈稻品種芽期和苗期耐冷性初步研究[J]. 雜交水稻，2015，30（5）：59-64.鄧惠清，唐燦明，劉正鑾，等. 陸地棉空間誘變SP1～SP3主要性狀變異分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（12）：64-67，74.