脹果甘草發(fā)芽率測定及總RNA提取初步研究

摘要：以脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）種子為試驗材料，通過實驗室培養(yǎng)出甘草幼苗，利用Trizol試劑法來獲取甘草葉片的總RNA，進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳和測定吸光度（D值）以確定RNA濃度及純度。試驗結(jié)果表明，甘草種子的萌發(fā)率可達(dá)85%以上，采用本研究的方法可得到較純RNA，紫外燈下可以觀察到明顯的28S、18S、5S的RNA條帶，分光光度計測得的D值均為1.85，由此可以看出本實驗室條件下培養(yǎng)的甘草萌發(fā)率較高，所獲取的RNA完整且純度較高。

關(guān)鍵詞：脹果甘草;發(fā)芽率;總RNA;Trizol試劑

甘草是多年生單子葉植物，外表顏色呈紅棕色，廣泛分布于新疆與內(nèi)蒙古地區(qū)，除此之外，在我國其他不少區(qū)域也有分布，是我國藥品大詞典記錄的藥物之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、日常生活以及化工等領(lǐng)域。甘草有3種，分別為具有抑制人類乳腺癌細(xì)胞作用的烏拉甘草（Glycyrrhiza uralensis），多應(yīng)用于食品工程的脹果甘草（Glycyrrhiza inflata），常用于化工品的光果甘草（Glycyrrhiza glabra）。甘草的根和莖多作為醫(yī)藥品用，本試驗僅利用甘草幼嫩葉片為試驗研究對象[1]。

甘草根部在土壤中的生長能力強，以縱橫交錯的發(fā)達(dá)根系適應(yīng)干旱地區(qū)的惡劣環(huán)境，具有較強的抗旱、抗寒、耐鹽堿及防御風(fēng)沙能力[2]。

當(dāng)前研究者對甘草的研究集中于其醫(yī)療上的作用，以及其生理特性和無性生殖培育上的探究，而對于甘草耐鹽性的評價與利用以及甘草耐鹽基因挖掘分析等方面鮮有報道。鹽堿性土壤不僅是影響新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的因素，而且是全國農(nóng)作物產(chǎn)量下降的主要因素。抗性資源基因的克隆與轉(zhuǎn)化，可以提高目標(biāo)植物的抗性，把甘草耐鹽性基因轉(zhuǎn)到其他農(nóng)作物可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量，能有效降低鹽堿性土壤對農(nóng)作物的影響[3]。

伴隨著現(xiàn)代克隆技術(shù)、分子生物科學(xué)、基因工程技術(shù)和基因組工程學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，植物耐鹽性基因的研究已經(jīng)逐步深入[4]。專家已經(jīng)證明了甘草體上存在耐鹽基因并研究了耐鹽性基因的功能，分析了耐鹽基因性狀的復(fù)雜性。耐鹽基因是植物體本身具有的基因之一，大量研究證明，利用耐鹽基因可看成對鹽堿區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受損農(nóng)作物的有效救助方法[5]。

為充分利用我國鹽堿地區(qū)的土地資源，合理增加鹽漬化地區(qū)的土壤利用效率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量[6]，本試驗開展脹果甘草發(fā)芽率測定及總RNA的提取技術(shù)研究，以期為甘草耐鹽性基因的克隆奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)的試驗提供樣品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）種子購于新疆喀什地區(qū)喀什市兩亞市場。由葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點實驗室鑒定。

1.2 試驗儀器

營養(yǎng)缽，100 mL燒杯，500 mL燒杯，250 mL錐形瓶，研缽，CT15R型高速冷凍離心機（Hitachi公司），G13型紫分光光度計（Eppendorf），15 μL EP管，眼罩，500 mL容量瓶，DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），電泳槽，F(xiàn)A2204N型電子天平，Eppendorf型10～100 μL移液器，Eppendorf型 100～1 000 μL移液槍，Eppendorf型20～200 μL移液槍，THERMO-SHAKER型超速混均器（江蘇金壇儀通電子有限公司），玻璃棒，M1-2270EGC型微波爐（海爾公司），TYAB024/10型高壓滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司），jy04S-3C凝膠成像系統(tǒng)（JUNYI），電子計時器，小型藥勺，小刀片。

1.3 試驗藥品與試劑

營養(yǎng)土，沙土，濃硫酸，液態(tài)氮，R21086型Trizol試劑（上海源葉生物科技有限公司），氯仿溶液，異丙醇溶液，焦炭酸二乙酯粉（DEPC），乙二胺四乙酸（EDTA），Na2EDTA·2H2O，冰乙酸溶液，雙蒸水溶液（去離子），溴乙錠溶液（EP染液），電泳緩沖液，75%乙醇溶液，鋁錠buffer，瓊脂粉，三羥甲基氨基甲烷粉（Tirs），10% TAE母液，DEPC水溶液，1%瓊脂糖凝膠電泳液。

1.4 試驗材料的培養(yǎng)及發(fā)芽率的測定

1.4.1 甘草種子的處理 把已經(jīng)準(zhǔn)備好的甘草種子在室溫條件下用適量的濃硫酸浸泡40 min左右，并每隔 5 min 用玻璃棒充分?jǐn)嚢?次，然后快速把濃硫酸倒掉，沖洗種子幾遍，再把種子在蒸餾水中浸泡12 h。

1.4.2 甘草種子的萌發(fā) 把準(zhǔn)備好的沙土與營養(yǎng)土按1 ∶ 1比例混合裝在營養(yǎng)缽里培育種子。每缽播種50粒，覆上細(xì)土，噴水。

1.4.3 甘草種子萌發(fā)過程的觀察 觀察種子的萌發(fā)特征，如果營養(yǎng)沙土比較干要澆水，如果土壤比較濕潤則噴水即可以。幼苗培育15～20 d后長到 3～4 cm 時可以用作試驗材料;并計算萌發(fā)率：

萌發(fā)率=（萌發(fā)種子數(shù)÷供試種子數(shù)）×100%。

1.5 試驗試劑配制

（1）75%乙醇溶液的配制：95%的乙醇溶液中按3.7 ∶ 1比例加入蒸餾水。

（2）10% TAE母液的配制：把已經(jīng)稱好的 24.2 g Tris、3.2 g Na2EDTA·2H2O裝入500 mL燒杯中，向燒杯中倒入400 mL去離子水，充分?jǐn)嚢韬?，用去離子水定容到500 mL后，室溫保存?zhèn)溆?，用的時候稀釋10倍。

（3）DEPC水溶液的配制：按1 ∶ 1的比例，每500 mL蒸餾水中加入500 mL DEPC，配好后在室溫下超凈工作臺上放置十幾個小時，121 ℃ 滅菌30 min。

（4）1%瓊脂糖凝膠電泳液的配制：稱取瓊脂糖粉0.24 g，加經(jīng)過DEPC處理的ddH2O 12.04 mL，用微波爐加熱，加熱到沸騰，瓊脂糖溶液顏色透明為止，保存?zhèn)溆?，用的時候加熱熔化。

1.6 甘草葉片總RNA的提取及檢測

利用Trizol試劑提取植物總RNA是各種植物提取RNA使用最廣泛的方法之一。

1.6.1 提取之前的準(zhǔn)備工作 （1）首先把槍頭、EP管消毒滅菌，各個玻璃儀器和試驗工具烘干，避免裂解酶的污染。（2）使用Trizol試劑和溴乙錠（EB）、DEPC等毒性藥品時要帶手套和眼罩，要穿防護服并且在通風(fēng)的條件下進(jìn)行取用，避免中毒。（3）在進(jìn)行每一步試驗操作之前要換手套，其次在試驗過程操作人員和操作旁觀者，避免多說話避免外界環(huán)境中的RNA裂解酶的污染。（4）所有的試劑盒必須要用DEPC水處理滅菌后再次放在烘干箱內(nèi)121 ℃進(jìn)行滅菌。

1.6.2 使用Trizol試劑提取總RNA 首先在研缽內(nèi)倒入少量無水乙醇，用打火機點燃消毒后，快速加入液氮，取切好的甘草葉片100～150 mg置于研缽內(nèi)，再快速加入足夠的液氮，研磨至粉末狀態(tài)，將研磨后的樣品細(xì)心加入到2個離心管中，用20～200 μL移液槍再加入Trizol試劑1 mL，分別反復(fù)充分混合后，室溫放置15 min讓核蛋白混合物分離，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管中再加入0.2 mL的氯仿溶液蓋好EP管蓋子，用手劇烈搖蕩離心管15 s，室溫下放置 3 min，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，分3層再取上清液移到新的離心管，加入0.5 mL的異丙醇溶液，蓋上管子室溫放置10 min，在4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，加入75%乙醇洗滌沉淀，再倒掉上層液，然后在室溫條件下插入冰片內(nèi)靜置 10 min 干燥多余的乙醇后，加入DEPC水溶解沉淀。把樣品標(biāo)好號碼在-20 ℃保存待用。

1.7 RNA瓊脂糖凝膠電泳

1.0%的瓊脂糖在微波爐熔化，注入到已備好的電泳槽里，再用 1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠電泳水，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠，用10～100 μL移液槍吸取含總RNA樣品4 μL的鋁錠bufeer緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，然后打開電泳儀電泳開關(guān)，電壓調(diào)節(jié)到100 V后，讓RNA樣品從負(fù)極走向正極電泳方向，大約30 min后把凝膠放入EP染液中染色 5 min，用水沖洗1次，在紫外檢測燈下觀察RNA電泳條帶，然后用照相儀器記錄好條帶相，分析結(jié)果。

1.8 總RNA的D值測定及RNA得率的計算

D值測定具體步驟如下：取EP管里用10～100 μL 的移液槍取少量待測的RNA樣品，用DEPC水稀釋100倍，在260 nm、280 nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計的讀數(shù)為零，再加入待測RNA樣品在波長處讀取D值。

RNA得率（μg/g）=D260 nm×稀釋倍數(shù)×40/1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子處理和萌發(fā)過程數(shù)據(jù)處理結(jié)果

通過98%濃硫酸處理，在提供充足的光照、水、營養(yǎng)成分、氧氣時甘草種子的萌發(fā)率可達(dá)85%以上。脹果甘草萌發(fā)率數(shù)據(jù)和萌發(fā)情況見表1。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳條帶結(jié)果與分析

瓊脂糖凝膠電泳法是檢測植物總RNA的一種主要檢測方法，從凝膠成像系統(tǒng)所觀察的條帶不僅可以判斷RNA的完整性與裂解程度，也能判斷出所得RNA內(nèi)有沒有含蛋白質(zhì)、多糖，以及DNA等污染雜質(zhì)成分。所獲得的RNA凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看到，瓊脂糖平面上的3個條帶，分別為28S、18S和5S，各個條帶之間分層明顯且無缺，沒有發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，點樣孔干凈，說明獲取的RNA比較完整，基本沒有蛋白質(zhì)、多糖、DNA等雜質(zhì)污染。

2.3 總RNA吸光度（D值）檢測結(jié)果與分析

RNA樣品的D260 nm/D280 nm的比值為1.8～2.0時，獲得的RNA較純。如比值比較低，說明有殘余DNA或蛋白質(zhì)存在或其中發(fā)生酚污染，如果比值太高說明RNA有降解。本試驗中所獲得的RNA的D值（表2）顯示，3次所得到的D260 nm/D280 nm平均值為1.85，得率平均值為3.263 μg/mL，此值表明所獲得的RNA純度較高。

3 結(jié)論與討論

本試驗以脹果甘草種子為試驗材料，在實驗室條件下培養(yǎng)出甘草幼苗，測定甘草萌發(fā)率，利用Trizol試劑提取甘草幼苗葉片莖總RNA的提取方法。從萌發(fā)率測定結(jié)果和總RNA提取結(jié)果可以得出，經(jīng)過98%濃硫酸處理，并提供充足的光照、水、營養(yǎng)成分、氧氣時甘草種子的萌發(fā)率為可達(dá)80%以上。

對植物材料進(jìn)行cDNA擴增及后續(xù)研究工作，需提取高質(zhì)量、高反轉(zhuǎn)錄活性的總RNA[7-8]。前人已經(jīng)對鹽生植物材料如梭梭[9]、沙棘[10]、駱駝蓬[11]、鹽芥[12]等葉片的總RNA提取研究，但是由于植物總RNA的提取具有很強的種屬和組織的特異性，因此，需要根據(jù)不同物種及不同組織的特性選擇或改良相應(yīng)的方法。本研究采用Trizol法提取甘草葉片RNA，與已經(jīng)報道的部分鹽生植物的RNA提取方法不同。本試驗用Trizol法提取的總RNA的D260 nm/D280 nm的值為1.85，表明提取的總RNA純度較高。植物RNA的主要成分是28S、18S和5S rRNA，RNA有無降解及降解的程度，以及是否存在DNA、蛋白質(zhì)和多糖的污染都可以從電泳膠上28S和18S rRNA的完整性來判斷。本試驗所提取的RNA在1.0%的非變性凝膠電泳結(jié)果顯示，28S和18S的比值接近2 ∶ 1，說明RNA沒有降解，可用于后續(xù)的試驗。

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