東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTLqCTS3.3候選基因LOC_Os03g54970冷脅迫下熒光定量表達(dá)分析及克隆

卻志群 黃貴忠 沈春修

摘要：為了驗證東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3的功能，結(jié)合筆者所在課題組前期完成的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，將落在qCTS3.3 QTL 2個最近側(cè)翼分子標(biāo)記MK149624和MK137032之間區(qū)域的差異表達(dá)基因 LOC_Os03g54970-DX作為qCTS3.3的候選基因，并通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）對不同低溫處理時間長度該基因在東鄉(xiāng)野生稻葉片中的表達(dá)水平進(jìn)行了相對定量分析，結(jié)果表明，該基因在低溫脅迫處理前后表達(dá)量呈現(xiàn)出低—高—低—高的變化趨勢，隨后，參照測序水稻品種日本晴對應(yīng)的該基因位點的序列信息設(shè)計引物，通過RT-PCR技術(shù)從東鄉(xiāng)野生稻中成功擴(kuò)增到了LOC_Os03g54970-DX基因的全長cDNA，構(gòu)建了該基因位點的過表達(dá)載體。測序分析結(jié)果表明，東鄉(xiāng)野生稻中的LOC_Os03g54970-DX基因序列與日本晴中的對應(yīng)位點序列完全一致，進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將東鄉(xiāng)野生稻中的LOC_Os03g54970-DX的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻受體品種TP309，最終獲得了48株轉(zhuǎn)基因植株，研究結(jié)果為下一步研究東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os03g54970-DX基因位點在冷脅迫作用條件下的功能機(jī)制奠定了材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：東鄉(xiāng)野生稻;RT-PCR;熒光定量;QTL

冷害（倒春寒和寒露風(fēng)）是水稻生產(chǎn)遇到的一個普遍問題，我國每年因低溫冷害損失稻谷30～50億kg[1-2]。近年來，隨著我國土地流轉(zhuǎn)政策的實施、城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快以及農(nóng)村勞動力的轉(zhuǎn)移，在農(nóng)業(yè)機(jī)械化和輕簡栽培技術(shù)背景下，直播技術(shù)以及免耕加直播技術(shù)逐漸被推廣，對水稻品種的耐寒性提出了更高的要求，迫切需要強(qiáng)抗寒的水稻品種。如何提高水稻抗寒性已成為全國水稻科研工作者普遍關(guān)注的問題，而提高水稻抗寒能力最有效的方法就是挖掘和利用水稻自身耐冷基因[3]。

東鄉(xiāng)野生稻（Dongxiang Oryza rufipogon Griff.）屬于普通野生稻的一種，原生地位于江西省撫州市東鄉(xiāng)縣（28°14′N，116°36′E），是目前為止發(fā)現(xiàn)的起源地分布位置最靠北的野生稻。東鄉(xiāng)野生稻的地下莖部分能夠耐受-12.8 ℃的低溫冷害[4]，它或許能成為一個改良栽培稻耐寒性的寶貴遺傳資源。目前，已經(jīng)有一些關(guān)于東鄉(xiāng)野生稻耐寒性遺傳分析和潛在的耐冷分子機(jī)制方面的研究報道，不同研究者以東鄉(xiāng)野生稻為材料，分別將控制東鄉(xiāng)野生稻苗期、孕穗期和花期的耐冷數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，簡稱QTL）定位在1、3、4、6、8、10、11號染色體上[5-9]。但由于受東鄉(xiāng)野生稻遺傳背景復(fù)雜和以簡單重復(fù)序列（SSR）為代表的老一代分子標(biāo)記在染色體特定區(qū)段數(shù)目有限的制約，目前，通過這種定位克隆方法依然還沒有從東鄉(xiāng)野生稻中克隆到耐冷基因，直到Li等通過對東鄉(xiāng)野生稻中的一個類bHLH（basic helix-loop-helix）蛋白基因OrbHLH001進(jìn)行過表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了該基因能夠增強(qiáng)擬南芥的耐冷性[10]，這也是目前唯一從東鄉(xiāng)野生稻中克隆到的耐冷基因，然而沒有證據(jù)表明該基因可以解釋東鄉(xiāng)野生稻的所有強(qiáng)耐冷性表現(xiàn)。另外，值得一提的是，Mao等利用東鄉(xiāng)野生稻與協(xié)青早B雜交后的回交重組自交系（BILs）和重組自交系（RILs）2個后代群體[11]，借助特異性位點擴(kuò)增片段測序（specific-locus amplified fragment sequencing，簡稱SLAF-Seq）技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，通過區(qū)間作圖和單一位點分析相結(jié)合的方法在東鄉(xiāng)野生稻多條染色體上鑒定到了15個與苗期耐冷相關(guān)的QTL，由于這一研究基于第2代測序技術(shù)開發(fā)了大量特異性位點擴(kuò)增片段（SLAF）分子標(biāo)記用于構(gòu)建東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL的高密度遺傳圖譜，因此，該研究相對準(zhǔn)確、完整地鑒定了東鄉(xiāng)野生稻所攜帶的苗期耐冷QTL數(shù)目及其在染色體上的位置信息。筆者前期通過比較轉(zhuǎn)錄組分析獲得了冷脅迫條件（4 ℃處理3 d）下在2個耐冷水稻材料中[包括耐冷東鄉(xiāng)野生稻以及東鄉(xiāng)野生稻與冷敏感秈稻93-11雜交產(chǎn)生的F2代可越冬混合群體（over-wintered offspring population，簡稱OOP），由20株能夠在湖南長沙成功越冬的F2后代植株組成]出現(xiàn)差異表達(dá)而在冷敏感水稻材料93-11中未表現(xiàn)出差異表達(dá)的462個東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷相關(guān)差異表達(dá)基因（differentially expression genes，簡稱DEGs）[12]。

本研究基于Mao等發(fā)表的15個東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL側(cè)翼標(biāo)記的序列信息[11]，結(jié)合筆者前期的比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果[12]，將落在qCTS3.3 QTL的2個最近側(cè)翼分子標(biāo)記之間區(qū)域的耐冷相關(guān)差異表達(dá)基因LOC_Os03g54970作為qCTS3.3的候選基因，以東鄉(xiāng)野生稻作為試驗材料，運用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了東鄉(xiāng)野生稻幼苗葉片中該基因在低溫處理條件下的表達(dá)量情況，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR）方法克隆東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os03g54970-DX基因位點的全長cDNA，構(gòu)建該全長cDNA基因過表達(dá)載體，然后借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入水稻受體品種TP309中，獲得了成功導(dǎo)入該目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，本研究內(nèi)容旨在為后續(xù)研究東鄉(xiāng)野生稻中 LOC_Os03g54970-DX 基因在冷脅迫作用下的功能機(jī)制奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料 供試水稻材料為東鄉(xiāng)野生稻，轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻品種TP309。

1.1.2 供試菌株和載體 農(nóng)桿菌（EHA105）;大腸桿菌（DH5α）;T載體（pEASY-Blunt Zero Cloning-Kit）;植物雙元過表達(dá)載體pCAMBIA1301M（圖1）。

1.2 試驗方法

重組質(zhì)粒pCAMBIA1301M-54970-DX測序結(jié)果表明，LOC_Os03g54970-DX基因的cDNA全長共1 524 bp，首先使用DNA序列分析軟件DNASTAR將東鄉(xiāng)野生稻中克隆到的LOC_Os03g54970-DX全長cDNA序列和Rice Genome Annotation project公共數(shù)據(jù)庫中公布的水稻品種日本晴的對應(yīng)位點序列分別轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，然后在序列分析軟件DNAMAN中進(jìn)行氨基酸序列的同源比較分析。結(jié)果表明，該基因位點在東鄉(xiāng)野生稻和日本晴中都編碼507個氨基酸，且二者在這一基因位點編碼的氨基酸呈現(xiàn)出了100%的同源性（圖6）。

2.5 LOC_Os03g54970-DX基因過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化

將攜有pCAMBIA1301M-54970-DX的農(nóng)桿菌克隆在含利福平和卡那霉素的固體平板上接種活化，培養(yǎng)2～3 d后將農(nóng)桿菌使用含乙酰丁香酮的液體共培養(yǎng)基洗下，然后侵染預(yù)培養(yǎng)3 d的TP309愈傷組織，經(jīng)后續(xù)農(nóng)桿菌克隆與愈傷組織共培養(yǎng)、于含潮霉素的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性愈傷組織選擇培養(yǎng)、在含潮霉素的分化培養(yǎng)基上見光培養(yǎng)以及生根培養(yǎng)（圖7），最后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS（β-葡萄糖苷酸酶）染色鑒定，圖8所示為本研究中部分轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色檢測結(jié)果，5株轉(zhuǎn)基因植株的葉片在葉尖部位和剪切過的切口處都染上了明顯的藍(lán)色，而野生型轉(zhuǎn)基因受體水稻TP309的葉片則沒有能夠被染上藍(lán)色，表明被檢測的轉(zhuǎn)化植株都為成功導(dǎo)入了LOC_Os03g54970-DX基因的陽性植株。最終，本研究獲得了48株成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒pCAMBIA1301M-54970-DX的轉(zhuǎn)基因陽性植株。

3 討論

Weiser研究表明，植物的耐冷性表現(xiàn)被誘導(dǎo)的過程其實是植物通過調(diào)控自身基因表達(dá)發(fā)生改變的過程[14]。換句話說，植物攜帶的與寒冷逆境相關(guān)基因是一種冷誘發(fā)表達(dá)基因，耐冷基因的表達(dá)往往是在低溫和短日照等特定條件誘導(dǎo)下才得以啟動，耐冷相關(guān)基因冷誘發(fā)表達(dá)之后才賦予了細(xì)胞抵御寒冷的能力。因此，植物在本身的耐冷相關(guān)基因表達(dá)之前，其抗寒能力僅僅只是植物的一種潛能[15]。

所以，從強(qiáng)耐冷的植物材料中挖掘克隆冷誘導(dǎo)表達(dá)基因，導(dǎo)入冷敏感植物中，或許可以作為一種增強(qiáng)冷敏感植物抗寒能力的有效手段。本研究利用Mao等公布的東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL所在染色體上的位置信息[10]，將低溫處理之后（4 ℃處理3 d）在東鄉(xiāng)野生稻和OOP中都出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)且剛好落在qCTS3.3 QTL區(qū)段的差異表達(dá)基因LOC_Os03g54970-DX作為東鄉(xiāng)野生稻qCTS3.3中的一個耐冷候選基因，由于水稻耐冷相關(guān)基因往往都是冷誘導(dǎo)表達(dá)基因，所以，這種將水稻耐冷基因QTL定位與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果相結(jié)合的基因克隆策略具有一定的合理性，在很大程度上便利了QTL區(qū)段耐冷候選基因的篩選，有可能加快水稻耐冷基因的挖掘進(jìn)程。

為了驗證LOC_Os03g54970-DX轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，本研究對東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os03g54970-DX基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)做了進(jìn)一步的熒光定量分析，通過qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os03g54970-DX在低溫脅迫處理3 d的時間內(nèi)表達(dá)量都出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。其中以低溫處理24 h內(nèi)LOC_Os03g54970-DX基因上調(diào)幅度最高，當(dāng)冷處理時間長達(dá)48 h和72 h時，LOC_Os03g54970-DX的表達(dá)量與冷處理24 h時相比都有明顯降低，但依然比冷處理前要高。這說明，LOC_Os03g54970-DX可能主要是在東鄉(xiāng)野生稻遭受冷脅迫后的前期（24 h內(nèi)）起作用，通過在低溫脅迫的前期大幅度提高自身表達(dá)量，以正調(diào)控的方式參與東鄉(xiāng)野生稻對低溫脅迫的響應(yīng)過程，幫助東鄉(xiāng)野生稻抵御低溫脅迫環(huán)境。

另外，本研究通過與日本晴中對應(yīng)位點的cDNA編碼的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，東鄉(xiāng)野生稻中的LOC_Os03g54970-DX基因序列與日本晴中對應(yīng)位點的序列完全一致，說明該基因位點的編碼區(qū)在東鄉(xiāng)野生稻和日本晴中具有較強(qiáng)的保守性，或許行使某種相同的功能作用。當(dāng)然，也存在這樣的可能性，LOC_Os03g54970-DX基因的啟動子區(qū)域或許與日本晴的對應(yīng)位點存在差異，LOC_Os03g54970-DX由于在啟動子區(qū)域與其他常規(guī)水稻品種的不同而在東鄉(xiāng)野生稻中行使某種特定功能。

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