異丙肌苷通過(guò)Src/ Ras和鈣信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶活性促進(jìn)T細(xì)胞增殖*

李亞芹，鄧林紅，歐陽(yáng)明星

(常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

1 引 言

T淋巴細(xì)胞(T lymphocyte)簡(jiǎn)稱(chēng)T細(xì)胞，在胸腺發(fā)育完成后，通過(guò)淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能[1]。T細(xì)胞免疫是機(jī)體防御腫瘤細(xì)胞和病原生物的屏障，其功能正常對(duì)人類(lèi)抵御疾病至關(guān)重要[2]。T細(xì)胞功能低下的人通常需要服用免疫調(diào)節(jié)藥物以維持人體健康。

異丙肌苷是一種免疫調(diào)節(jié)藥物，體外實(shí)驗(yàn)證明，它能促進(jìn)處于有絲分裂中的T細(xì)胞的分化和增殖[3]。但目前異丙肌苷促進(jìn)T細(xì)胞增殖的相關(guān)信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制尚不太清楚。本研究希望通過(guò)探究與T細(xì)胞活化增殖相關(guān)的分子如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、鈣離子(Ca2+)信號(hào)通路、非受體酪氨酸激酶Src/小G蛋白家族成員Ras的變化情況，以達(dá)到初步了解異丙肌苷促進(jìn)T細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制的目的。

ERK信號(hào)傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子[4]。目前已有研究表明，ERK活性可影響T細(xì)胞的活化增殖[5]?；诖耍狙芯繑M通過(guò)探討異丙肌苷是否上調(diào)ERK活性從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖。為了驗(yàn)證該猜想，使用了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技術(shù)原理的探針[6-7]，將ERK激酶FRET探針轉(zhuǎn)染進(jìn)入T細(xì)胞，檢測(cè)異丙肌苷對(duì)T細(xì)胞中ERK激酶活性的影響。

Src和Ras均為ERK上游信號(hào)分子，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)二者的活性對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育和功能至關(guān)重要[8-9]。因此,Src-Ras-ERK這條信號(hào)通路很有可能介導(dǎo)了異丙肌苷對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用。此外，F(xiàn)azal等[10]發(fā)現(xiàn)ERK活性受胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控，并且已有研究證明胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)影響T細(xì)胞的激活[11]，所以本研究還探討了Ca2+信號(hào)通路是否參與異丙肌苷的免疫調(diào)節(jié)作用。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

人T淋巴白血病細(xì)胞(Jurkat, Clone E6-1)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司；洛斯維·帕克紀(jì)念研究所(Roswell Park memorial institute, RPMI)-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，美國(guó)Gibco公司；Src抑制劑PP1、Ras抑制劑Salirasib，美國(guó)Sigma公司；異丙肌苷、ERK抑制劑PD98059和Ca2+抑制劑U71322，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK8溶液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；激光共聚焦培養(yǎng)皿，20 mm，無(wú)錫耐思生物科技有限公司；用于懸浮細(xì)胞的T重懸緩沖液和E電緩沖液電轉(zhuǎn)試劑，美國(guó)Thermo公司。

FRET顯微鏡平臺(tái)，Cell Observer, Zeiss Inc., 德國(guó)；倒置顯微鏡，Primo Vert, Zeiss Inc., 德國(guó)；電轉(zhuǎn)儀，Neon 0.5～ 2.5 Kv, Thermo Inc., 美國(guó)。

2.2 方法

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Jurkat細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃恒溫、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

2.2.2通過(guò)CCK8法篩選出異丙肌苷促進(jìn)T細(xì)胞增殖的最佳濃度 以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度將Jurkat細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入終濃度為0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL的異丙肌苷，每個(gè)濃度有10個(gè)重復(fù)組合。培養(yǎng)48 h后，向每孔加10 μL CCK8溶液。然后將培養(yǎng)板放至37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 450 nm值，進(jìn)而篩選出異丙肌苷促進(jìn)T細(xì)胞增殖的最佳濃度。

2.2.3Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染FRET探針 Jurkat細(xì)胞電轉(zhuǎn)FRET探針的操作步驟如下：在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱；按每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞來(lái)計(jì)算所需細(xì)胞量，將細(xì)胞懸液離心，用適量磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞兩次；加入T重懸緩沖液重懸細(xì)胞，加入1 μg微量質(zhì)粒于重懸液中，用移液槍吸10 μL混懸液；將移液槍插入電轉(zhuǎn)儀中，設(shè)電壓為1 325 V，時(shí)間為10 ms，電擊脈沖數(shù)為3次；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將移液槍中的液體加入至此前預(yù)熱的培養(yǎng)基中，放于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2.4FRET顯微鏡采集Jurkat細(xì)胞的FRET圖像 FRET顯微鏡系統(tǒng)配置有多點(diǎn)定位功能、自動(dòng)調(diào)焦功能以及維持溫度和5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)盒。FRET顯微鏡上，ECFP成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(480±20)nm；FRET成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(535±15) nm。FRET成像時(shí)，通過(guò)成像軟件自動(dòng)快速切換ECFP和FRET成像通道，以實(shí)現(xiàn)該雙通道圖像的實(shí)時(shí)采集。實(shí)驗(yàn)中，吸取100 μL細(xì)胞懸液置于共聚焦皿中間的玻璃孔上，放置于顯微鏡的細(xì)胞培養(yǎng)盒中，這里選擇較少量的培養(yǎng)液有助于減少T細(xì)胞的浮動(dòng)。接下來(lái)約10 min內(nèi)，通過(guò)成像軟件選定多個(gè)熒光細(xì)胞觀察位置，然后使用40或100倍油鏡，在顯微鏡下進(jìn)行多位點(diǎn)的FRET圖像采集。

2.2.5FRET圖像數(shù)據(jù)的定量分析及統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)以MATLAB軟件平臺(tái)開(kāi)發(fā)的FRET圖像分析軟件Fluocell 6.0.0(Lu S et al., 美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[12]，該軟件包的下載地址為：http://github.com/lu6007/fluocell。實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用統(tǒng)計(jì)分析軟件Origin 8.0(Originlab Inc., 美國(guó))和GraphPad Prism 6.0(GraphPadSoftware Inc., 美國(guó))進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 異丙肌苷激活Jurkat細(xì)胞的ERK活性

為了確定異丙肌苷促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖的最佳藥物濃度，細(xì)胞培養(yǎng)中加入不同濃度梯度的異丙肌苷，共培養(yǎng)48 h后，通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，異丙肌苷濃度為80 μg/mL時(shí)促細(xì)胞增殖效果最明顯，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇異丙肌苷的作用濃度為80 μg/mL。

接下來(lái)分析異丙肌苷是否影響到細(xì)胞內(nèi)的ERK激酶活性。轉(zhuǎn)染ERK FRET的Jurkat細(xì)胞在添加80 μg/mL異丙肌苷條件下培養(yǎng)48 h后在FRET顯微鏡下進(jìn)行熒光成像。通過(guò)FRET定量和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，表明異丙肌苷能明顯激活Jurkat細(xì)胞中ERK活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERK激酶是否調(diào)控異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞的促增殖作用，以添加80 μg/mL異丙肌苷的Jurkat細(xì)胞為對(duì)照組，在此基礎(chǔ)上用10 μmol/L的ERK抑制劑PD98059處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)48 h后，通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖差異。結(jié)果見(jiàn)圖3，ERK抑制劑明顯抑制了異丙肌苷促Jurkat細(xì)胞增殖效果。這些結(jié)果顯示異丙肌苷通過(guò)激活ERK促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖。

圖1 采用CCK8法檢測(cè)異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖影響(* P<0.05)Fig.1 The effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells detected by CCK8 assay(* P<0.05)

圖2 異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞中ERK活性的影響(* P<0.05)Fig.2 Effect of Isoprinosine on ERK activity in Jurkat cells(* P<0.05)

圖3 PD98059抑制了異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(* P<0.05)Fig.3 PD98059 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

3.2 Src激酶參與調(diào)節(jié)異丙肌苷激活ERK活性

Src激酶是調(diào)控ERK活性的重要上游信號(hào)之一，因此，本研究檢測(cè)Src是否參與調(diào)節(jié)異丙肌苷激活ERK，從而促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的增殖。通過(guò)加入10 μmol/L Src激酶抑制劑PP1并進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了異丙肌苷的促增殖作用，結(jié)果見(jiàn)圖4，證明了異丙肌苷促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖與Src/ERK信號(hào)通路相關(guān)。為了進(jìn)一步證明這一點(diǎn)，將轉(zhuǎn)染ERK FRET的Jurkat細(xì)胞用異丙肌苷處理48 h，再用PP1(10 μmol/L)處理3 h，進(jìn)行FRET成像，并和未經(jīng)PP1處理的對(duì)照組比較。結(jié)果見(jiàn)圖5， PP1能顯著抑制異丙肌苷誘導(dǎo)的ERK活性。因此Src激酶信號(hào)參與調(diào)控異丙肌苷誘導(dǎo)的ERK活性，促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖。

圖4 PP1抑制了異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(* P<0.05)Fig.4 PP1 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

圖5 PP1對(duì)異丙肌苷處理48 h的Jurkat細(xì)胞中ERK活性影響(* P<0.05)Fig.5 Effect of PP1 on ERK activity in Jurkat cells treated with Isoprinosine for 48 h(* P<0.05)

3.3 Ras激酶參與調(diào)節(jié)異丙肌苷激活ERK活性

Ras激酶處于Src激酶的下游，也是調(diào)控ERK活性的上游激酶之一。加入75 μmol/L Ras激酶抑制劑Salirasib，通過(guò)CCK8法發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了80 μg/mL異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，結(jié)果見(jiàn)圖6，表明異丙肌苷促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖與Ras/ERK信號(hào)通路相關(guān)。將轉(zhuǎn)染ERK FRET的Jurkat細(xì)胞用異丙肌苷處理48 h，然后用Salirasib(75 μmol/L)處理3 h，進(jìn)行FRET成像。結(jié)果見(jiàn)圖7，經(jīng)Salirasib處理后，Jurkat細(xì)胞群體水平上的ERK活性明顯降低。由圖7可知，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性分析也證實(shí)Salirasib能顯著抑制異丙肌苷誘導(dǎo)的ERK活性。因此異丙肌苷通過(guò)Ras/ERK信號(hào)通路去促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的增殖。

圖6 Salirasib抑制了異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(* P<0.05)Fig.6 Salirasib inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

3.4 異丙肌苷通過(guò)促進(jìn)Ca2+內(nèi)流影響Jurkat細(xì)胞增殖

Ca2+也是調(diào)控Ras/絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK/Erk kinase, MEK)/ERK通路的重要上游信號(hào)之一[13]，因此，本研究檢測(cè)了異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞中Ca2+信號(hào)的影響。通過(guò)將Miyawaki等[14]研發(fā)和改進(jìn)的Ca2+FRET探針轉(zhuǎn)染進(jìn)入Jurkat細(xì)胞，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度變化[6]。轉(zhuǎn)染Ca2+探針的Jurkat細(xì)胞加入異丙肌苷處理48 h，然后將異丙肌苷處理或?qū)φ瘴刺幚淼募?xì)胞置于共聚焦皿上，進(jìn)行FRET成像并比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8，異丙肌苷刺激了Jurkat細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證異丙肌苷是否可通過(guò)鈣信號(hào)通路影響Jurkat細(xì)胞的增殖，用Ca2+抑制劑U71322(20 μmol/L)處理與異丙肌苷共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞48 h后用CCK8法分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖9，U71322明顯抑制異丙肌苷促增殖的影響。

圖7 Salirasib對(duì)異丙肌苷處理48 h的Jurkat細(xì)胞中ERK活性影響(* P<0.05)Fig.7 Effect of Salirasib on ERK activity in Jurkat cells treated with Isoprinosine for 48 h(* P<0.05)

圖8 異丙肌苷刺激Jurkat胞漿Ca2+濃度上升(* P<0.05)

圖9 U73122抑制了異丙肌苷對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(* P<0.05)Fig.9 U73122 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

4 討論

體內(nèi)T細(xì)胞正?；罨菍?shí)現(xiàn)機(jī)體免疫功能的基本要求，具體表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞增殖、分化、分泌免疫因子等。已有研究表明，異丙肌苷作為免疫治療藥物能夠促進(jìn)T細(xì)胞的分化與增殖。本研究探索了異丙肌苷活化Jurkat細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)異丙肌苷能顯著激活Jurkat細(xì)胞中的ERK活性，并對(duì)其上游機(jī)制做了進(jìn)一步的研究。

Src和Ras是MEK-ERK通路的重要上游信號(hào)，影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂[16]。我們研究了異丙肌苷激活T細(xì)胞過(guò)程中Src/Ras的作用，通過(guò)使用Src/Ras抑制劑PP1/salirasib間接地證明了異丙肌苷需要通過(guò)Src/Ras信號(hào)上調(diào)ERK活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)異丙肌苷還可刺激Jurkat細(xì)胞Ca2+信號(hào)，幫助進(jìn)一步激活ERK活性從而影響細(xì)胞增殖。

綜上所述，我們研究了異丙肌苷促進(jìn)Jurkat細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制。異丙肌苷通過(guò)T細(xì)胞的胞內(nèi)Src/Ras和鈣信號(hào)上調(diào)其ERK活性，進(jìn)而影響Jurkat細(xì)胞的增殖。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究使用的Jurkat細(xì)胞屬于淋巴系白血病T細(xì)胞，所得到的研究結(jié)論值得進(jìn)一步用原代T細(xì)胞驗(yàn)證。盡管如此，此研究仍為異丙肌苷治療免疫性疾病及腫瘤的作用機(jī)制及應(yīng)用前景提供了一些依據(jù)，也為一些免疫治療新藥的研發(fā)帶來(lái)了一些啟發(fā)。