基于果實(shí)苦澀味新疆核桃資源遺傳多樣性分析

俞文君,金 強(qiáng),李 根,張 銳,吳翠云,王新建,于 軍

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

核桃(JuglansregiaL.)別名胡桃,為胡桃科胡桃屬喬木,溫帶樹種,位列世界四大干果之首,素有“木本油料之王”的稱號(hào)[1]。新疆產(chǎn)區(qū)核桃種質(zhì)資源十分豐富,存在大量野生種及栽培種,且栽培地域十分廣泛[2],主要分布在塔里木盆地周邊綠洲,如和田、阿克蘇、喀什等地,產(chǎn)量居全國前列。在東疆吐鄯托盆地以及北疆伊犁等地,野生核桃資源也聞名于世[3]。新疆野核桃屬于國家二級(jí)保護(hù)植物,經(jīng)長期自然雜交、實(shí)生繁殖,形成了后代遺傳變異程度高、品質(zhì)獨(dú)特、堅(jiān)果類型豐富的野生核桃種質(zhì)資源庫[4]。

核桃果實(shí)除含有豐富油脂外,還有酚類化合物、多種維生素及礦質(zhì)元素等。核桃仁外層,呈深淺不一淡黃色、黃色或褐色薄皮,稱為核桃內(nèi)種皮[5],核桃內(nèi)種皮含有大量酚類物質(zhì)[6-7],尤其是含有能沉淀蛋白質(zhì)、生物堿的水溶性單寧成分[8]。當(dāng)單寧與口腔中唾液蛋白結(jié)合會(huì)產(chǎn)生收斂性,即苦澀味,從而影響口感[9],進(jìn)而影響消費(fèi)者對核桃的食用量或青睞程度。

目前關(guān)于核桃多酚含量及提取方法的研究已引起相關(guān)學(xué)者關(guān)注,針對新疆核桃營養(yǎng)成分的研究也有相關(guān)報(bào)道,研究表明多酚和單寧與苦澀味有直接關(guān)系,目前關(guān)于干果苦澀品質(zhì)的研究報(bào)道還相對較少[10-14]。本文主要通過評價(jià)部分新疆核桃種質(zhì)果實(shí)苦澀味的相關(guān)品質(zhì),旨在發(fā)掘部分酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)極差的核桃種質(zhì)材料,篩選低苦澀味核桃種質(zhì)材料,為今后新疆核桃果實(shí)綜合品質(zhì)遺傳改良準(zhǔn)備中間材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃種質(zhì)材料 塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站、溫宿縣核桃種質(zhì)資源圃、溫宿縣木本糧油林場、葉城縣三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)(加依提勒克鄉(xiāng)布力米吾斯塘村、江格勒斯鄉(xiāng)代爾瓦扎庫木村、依提木孔鄉(xiāng)亞勒古孜巴格村),2018年9月2日至9月10日,在樹的樹冠中部外圍,采集發(fā)育正常的完熟期果實(shí)30個(gè),詳細(xì)情況見表 1;正己烷、甲醇、磷酸 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸 分析純,四川西隴化工有限公司;硫酸鋰、鎢酸鈉、鉬酸鈉 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;溴水 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水碳酸鈉 分析純,天津永晟精細(xì)化工有限公司;沒食子酸 分析純,天津市鼎盛鑫化工有限公司。

表1 供試核桃材料的編號(hào)、名稱及采樣地點(diǎn)Table 1 Number,name and sampling sites of the tested walnut material

TU-1800型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;X500R UPLC-Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀 美國AB公司;ODS3 C18(2.1 mm×50 mm)色譜柱 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外觀指標(biāo)測定 主要包括核桃果實(shí)單果重、縱徑、橫徑、側(cè)徑、果形指數(shù)、出仁率、殼厚度、縫合線高度,測定方法參考《農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定評價(jià)技術(shù)規(guī)范核桃》[15]。果形指數(shù)=果實(shí)縱徑/[(果實(shí)橫徑+果實(shí)側(cè)徑)/2],出仁率=果仁重/單果重×100。

1.2.2 苦澀味指標(biāo)測定

1.2.2.1 兒茶素、蘆丁、香草酸、槲皮素、綠原酸、沒食子酸含量測定 核桃肉磨粉,準(zhǔn)確稱取1.0000 g置于 15 mL 離心管中,先加入3 mL正己烷,充分振蕩1 min,10000 r/min離心,去掉上清(除去油脂),控干;之后加入4.0 mL 80%甲醇水溶液,常溫下浸泡2 h,然后超聲提取30 min 后,10000 r/min離心收集上層提取液,再加入4.0 mL 80%甲醇水溶液進(jìn)行超聲提取,離心收集合并提取液,以 80%甲醇定容至 10 mL,得供試品溶液;經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾,備用。

采用液質(zhì)聯(lián)用法(AB X500R UPLC-Q-TOF),色譜柱為島津ODS3 C18(2.1 mm×50 mm),流動(dòng)相A為0.25%甲酸水,流動(dòng)相B為0.25%甲酸乙腈溶液,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫為35 ℃,定性分析:本文按照多離子反應(yīng)檢測(MRM)結(jié)果來確定。

表2 苦澀味分析梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for bitterness analysis

1.2.2.2 單寧含量的測定 單寧含量的測定:分光光度法[16]。稱取果樣1 g,用80 mL水洗入100 mL容量瓶,放入沸水浴中提取30 min,取出,冷卻,定容,吸取1.0 mL提取液,分別加入5.0 mL水,1 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液,在765 nm波長下測定樣品溶液的吸光度。回歸方程:y=0.2987x-0.0172,相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖,DPS進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃果實(shí)外觀及苦澀味相關(guān)指標(biāo)變異情況

為了解所選核桃種質(zhì)資源外觀指標(biāo)變異情況及苦澀味指標(biāo)含量變異情況,對核桃果實(shí)外觀指標(biāo)及苦澀味指標(biāo)含量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、最大值、最小值和多樣性指數(shù)進(jìn)行了分析,結(jié)果見表3。可以看出,不同外觀指標(biāo)及苦澀味指標(biāo)含量的變異系數(shù)不同,外觀指標(biāo)中,其中果仁重的變異系數(shù)最大為53.686%,果形指數(shù)的變異系數(shù)最小為7.501%;苦澀味指標(biāo)中,其中蘆丁含量的變異系數(shù)最大為227.612%,兒茶素的變異系數(shù)最小為13.563%,從遺傳多樣性指數(shù)來看,外觀指標(biāo)中,多樣性指數(shù)的范圍在0.015～2.123,平均多樣性指數(shù)為0.449?？酀吨笜?biāo)中,多樣性指數(shù)變動(dòng)范圍在 0.015～171.81之間,平均多樣性指數(shù)為 25.065,蘆丁的變異系數(shù)較高,但單寧的多樣性指數(shù)較高。

表3 核桃果實(shí)外觀及苦澀味品質(zhì)性狀變異比較(n=38)Table 3 Comparison of walnut fruit appearance and bitter taste quality character variation(n=38)

可見變異系數(shù)和遺傳多樣性在核桃果實(shí)外觀及顯苦澀味指標(biāo)上表現(xiàn)得并不一致,說明核桃果實(shí)中蘆丁變異性廣泛,但其分布均勻度較低,果實(shí)中單寧含量變異程度較小,但其遺傳豐富度較高。

2.2 核桃果實(shí)苦澀味指標(biāo)的相關(guān)性

對核桃果實(shí)中苦澀味指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表4),結(jié)果表明,槲皮素與蘆丁呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)相關(guān)性高達(dá) 73%,隨著槲皮素含量增加蘆丁含量增加;沒食子酸與兒茶素、槲皮素呈顯著性正相關(guān)(P<0.05),說明隨著沒食子酸含量增加兒茶素與槲皮素含量也隨之增加;沒食子酸與香草酸呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05),說明隨著沒食子酸含量增加香草酸含量降低;單寧與兒茶素、沒食子酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),說明隨著單寧含量增加兒茶素與沒食子酸含量隨之增加。

表4 核桃果實(shí)中顯苦澀味指標(biāo)含量的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of bitter taste in walnut fruit

2.3 核桃果實(shí)苦澀味指標(biāo)主成分分析

對38個(gè)核桃品種的7個(gè)苦澀味指標(biāo)進(jìn)行主成分分析,從表5可以看出,4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為 83.58%,基本包括了苦澀味指標(biāo)的所有具有的信息,可將原來的7個(gè)苦澀味指標(biāo)轉(zhuǎn)化成4個(gè)主成分,第1主成分的特征值為2.4168,方差貢獻(xiàn)率為34.53%,代表7個(gè)苦澀味指標(biāo)的34.53%的信息;第2主成分的特征值為1.4749,方差貢獻(xiàn)率為21.07%,方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為55.60%,第3主成分的特征值為1.1028,貢獻(xiàn)率為15.75%，累計(jì)貢獻(xiàn)率71.35%;第4主成分的特征值為0.8561,方差貢獻(xiàn)率為12.23%,累計(jì)貢獻(xiàn)率為83.58%。由表5可知,在第1 主成分主要是蘆丁、槲皮素、沒食子酸及單寧對苦澀味的貢獻(xiàn)大;在第2主成分中起作用的蘆丁、槲皮素,其中兒茶素、沒食子酸、單寧為負(fù)值,說明兒茶素、沒食子酸、單寧與第二主成分的影響為負(fù)相關(guān);在第3主成分中起作用的為香草酸,綠原酸為負(fù)值,說明綠原酸對第三主成分的影響為負(fù);在第4主成分中起作用的為香草酸和綠原酸。從主成分分析的結(jié)果可以看出核桃果肉中兒茶素、蘆丁沒食子酸等指標(biāo)基本囊括了核桃苦澀味指標(biāo)信息。

表5 核桃果實(shí)苦澀味指標(biāo)含量主成分分析Table 5 Principal component analysis of bitter taste index content of walnut fruit

表6 38個(gè)核桃種質(zhì)材料苦澀味指標(biāo)均值Table 6 Mean bitter taste index of 38 walnut germplasm materials

2.4 核桃果實(shí)外觀及苦澀味指標(biāo)聚類分析

由圖1可知,根據(jù)核桃外觀指標(biāo)及苦澀味指標(biāo)含量,對38份核桃種質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(歐式距離,類平均法),在距離1197左右處,可將核桃種質(zhì)分為4類,第Ⅲ類包含的核桃種質(zhì)資源最多,有20 份資源,其次是第Ⅰ類有 16 份資源,第Ⅱ類和第Ⅳ類最少,僅一份資源為加州黑核桃1和南6-4。第Ⅰ類 16 份資源中,包括加州黑核桃2、3、4、5、7、8及中寧魁、中寧魁大、中寧行16、元丹等10份砧木用種質(zhì)資源,中4-12,中3-16也在其中。第Ⅱ類中僅有 1 份加州黑核桃1,第Ⅲ類包括南半1-22、葉城150年、葉城170年等主要為常規(guī)栽培品種及其實(shí)生后代,第Ⅳ類中也僅有1份南6-4核桃自然實(shí)生后代種質(zhì),其單寧含量最高。

圖1 核桃果實(shí)外觀及顯苦澀味指標(biāo)含量聚類Fig.1 Cluster of the appearance and the component of bitter and astringent taste in walnut fruit

3 討論與結(jié)論

澀味是口腔上皮細(xì)胞暴露在明礬或單寧溶液中,產(chǎn)生一種干燥、收斂、粗糙的復(fù)合感覺[17]。食品中未成熟的果實(shí)、堅(jiān)果、茶及紅酒等均具有澀感,具有澀味的化學(xué)物質(zhì)主要有明礬類與多酚類[18]。

苦澀味來源于多酚類物質(zhì),高麗萍教授課題組研究證明,茶葉中多酚類物質(zhì)主要是兒茶素,兒茶素分為單體兒茶素和酯型兒茶素,其中酯型兒茶素約占 70%,是影響茶葉苦澀味的主要成分[18]。2003年德國學(xué)者Scharbert等[19-20]發(fā)現(xiàn)酯型兒茶素是綠茶苦澀味的主體,苦味物質(zhì)主要為咖啡堿和EGCG,蘆丁(茶葉中的黃酮苷)自身沒有明顯的滋味,但有增強(qiáng)咖啡堿苦味的作用。茶葉的苦味成分主要包括生物堿、氨基酸、茶皂素、多酚類物質(zhì),其中黃烷醇類,黃烷酮類、黃酮醇類、花色素類等多酚類物質(zhì)同時(shí)具有苦味和澀味[21]。乜蘭春等[22]研究蘋果果實(shí)酚類物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)綠原酸、兒茶素、表兒茶素和原花青素是引起蘋果果實(shí)澀感的主要物質(zhì)。

果實(shí)中的苦澀味物質(zhì)經(jīng)常影響其食用和加工品質(zhì),是果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)之一,引起果實(shí)澀味的主要物質(zhì)也是單寧以及其他少數(shù)幾種酚類物質(zhì),澀味物質(zhì)有時(shí)可以增加果實(shí)口感,當(dāng)澀味物質(zhì)含量過多時(shí),就會(huì)引起消費(fèi)者的不適應(yīng)[23-24]。新疆主要栽培核桃品種整體口感品質(zhì)多年來很受各地經(jīng)銷商和消費(fèi)者青睞,尤其以‘新溫81’、‘新新2’、‘新溫185’等品種為代表品種[25]。但是隨著核桃栽培面積在全國各地不斷擴(kuò)大[26],核桃的消費(fèi)量仍然沒有明顯上升,價(jià)格也呈一定下降趨勢。雖然核桃果實(shí)富含多種保健營養(yǎng)成分,消費(fèi)者人均消費(fèi)核桃量還不是很多[27]。究其原由,主要受到了核桃果實(shí)所含苦澀味物質(zhì)的影響,造成人們每次食用數(shù)量不多。

本研究結(jié)果顯示,核桃果實(shí)品質(zhì)性狀變異豐富,表現(xiàn)出不同程度的遺傳多樣性。外觀指標(biāo)中果仁重、縫合線高度、出仁率的變異系數(shù)較大;顯苦澀味指標(biāo)中蘆丁、槲皮素、香草酸的變異系數(shù)較大。外觀指標(biāo)中單果重、果仁重、平均三徑的多樣性指數(shù)較大;顯苦澀味指標(biāo)中單寧、綠原酸、沒食子酸、兒茶素的多樣性指數(shù)較大,充分反映了這些性狀的遺傳多樣性及豐富程度,具有較為豐富的遺傳信息和利用潛力。外觀指標(biāo)中果形指數(shù)變異系數(shù)較低,苦澀味指標(biāo)中兒茶素的變異系數(shù)較低,反映其離散程度較低,性狀遺傳穩(wěn)定。對來源不同的新疆核桃種質(zhì)進(jìn)行對比分析可知,砧木類型其苦澀味含量較低,栽培品種外觀品質(zhì)較優(yōu)良。自然實(shí)生后代中發(fā)現(xiàn)南6-4單寧含量最高,而且綜合聚類分析結(jié)果顯示南6-4的遺傳基礎(chǔ)深厚、進(jìn)化程度較低,該材料可能含有較多其它優(yōu)良性狀,可作為今后本地核桃砧木品質(zhì)改良和新品種選育的親本或中間材料。

基于苦澀味物質(zhì)和綜合外觀的多樣性聚類分析發(fā)現(xiàn),引進(jìn)加州黑核桃主要和部分取自溫宿縣核桃林場、溫宿縣核桃資源圃以及溫宿縣核桃林場的幾個(gè)“中寧”品種及新疆本地自然實(shí)生后代核桃種質(zhì)聚在一類,表明在苦澀物質(zhì)成分方面,加州黑核桃和新疆本地核桃有相似之處。經(jīng)該研究探索,發(fā)現(xiàn)苦澀品質(zhì)方面,新疆阿克蘇當(dāng)?shù)刂髟云贩N比幾個(gè)引進(jìn)加州黑核桃和“中寧”核桃品種高,且變異幅度較大,為今后對新疆當(dāng)?shù)睾颂曳N質(zhì)苦澀味品質(zhì)遺傳改良工作鋪墊了較好的種質(zhì)材料空間,也為新疆當(dāng)?shù)睾颂曳N質(zhì)苦澀品質(zhì)優(yōu)化提供了可能性。