復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁菌種篩選與工藝優(yōu)化

仵白敏,楊文博,劉 慧,張春嶺,劉杰超,焦中高

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,河南鄭州 450009)

益生菌是指食用一定數(shù)量后對宿主健康有益的一類微生物[1],主要包括乳桿菌、雙歧桿菌、乳球菌、鏈球菌、明串珠菌等[2-4],具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、保護(hù)腸道屏障功能、提高免疫力、抗過敏等生理作用,對腸炎、應(yīng)激性結(jié)腸綜合征、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、癌癥等多種疾病具有防治作用[3-7]。乳制品是益生菌應(yīng)用最多、最為成熟的食品領(lǐng)域,但乳制品含有較高的脂肪和膽固醇,而且部分人群還存在乳糖不耐、乳蛋白過敏等健康風(fēng)險(xiǎn),限制了益生菌發(fā)酵乳制品的消費(fèi)[8]。因此,尋找其它非乳原料作為益生菌載體成為研究熱點(diǎn)。

水果富含糖、酸、黃酮、胡蘿卜素、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì),是益生菌發(fā)酵的理想基質(zhì)[2]。李維妮等[9]利用副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌協(xié)同發(fā)酵蘋果汁,在最佳工藝條件下得到的活菌數(shù)可達(dá)1.985×108CFU/mL。羅心欣等[10]利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵獼猴桃汁,最優(yōu)工藝條件下活菌數(shù)為2.185×108CFU/mL。一些果汁經(jīng)益生菌發(fā)酵后多酚、γ-氨基丁酸等生物活性物質(zhì)的含量和抗氧化活性得到提高[11-15],說明適宜的益生菌發(fā)酵可作為改善果汁功能特性的重要手段。

當(dāng)前用于果汁發(fā)酵的乳酸菌以牛奶發(fā)酵菌株較多,但由于果汁具有較高的酸度,牛奶發(fā)酵菌株難以適應(yīng)果汁的高酸環(huán)境,造成其在果汁中發(fā)酵能力有限,不能有效發(fā)酵果汁產(chǎn)生良好的風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)[16],因此篩選適用于不同種類果汁發(fā)酵的專用菌株并完善發(fā)酵工藝成為益生菌發(fā)酵果汁產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。本研究以巨玫瑰葡萄為原料,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,得到適宜葡萄汁發(fā)酵的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)21802和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)6239,并將兩株菌進(jìn)行復(fù)配,以活菌數(shù)和感官評分為指標(biāo),對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期為益生菌發(fā)酵葡萄汁的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨玫瑰葡萄 采于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所新鄉(xiāng)基地;布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)6067、檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)23234、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)6001、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)22241、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)24450、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)22184、唾液乳桿菌水楊素亞種(Lactobacillussalivariussubsp.salicinius)21808、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)6239、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)21798、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)21822、植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)21830、植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)22703、類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)22709、棒狀乳桿菌棒狀亞種(Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis)22701、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)21800、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)21865、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)21832、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)6222、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)21802、消化乳桿菌(Lactobacillusalimentarius)21852和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)21838 購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;MRS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;Folin-酚試劑 美國Sigma公司;沒食子酸 上海源葉生物科技有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

JYL-G12E榨汁攪拌機(jī) 中國九陽股份有限公司;D-500大龍均質(zhì)勻漿機(jī) 賽伯樂(上海)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;WFJ 7200型可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄汁的制備

1.2.1.1 工藝流程 葡萄→挑選→清洗→打漿→滅酶→冷卻→均質(zhì)→殺菌→葡萄汁

1.2.1.2 關(guān)鍵操作要點(diǎn) 打漿與滅酶:將清洗干凈的葡萄于榨汁攪拌機(jī)中勻漿至果粒充分破碎,立即置于沸水中水浴5 min滅酶。

均質(zhì):使用均質(zhì)勻漿機(jī)將滅酶冷卻后的葡萄汁于25 ℃均質(zhì)(500 W,20 min)。

殺菌:將均質(zhì)后的葡萄汁分裝于250 mL的錐形瓶中,裝液量100 mL,用透氣封口膜封口,置于壓力蒸汽滅菌器滅菌(95 ℃,10 min),然后冷卻至室溫備用。

1.2.2 菌種活化與種子液制備 將益生菌菌粉接種于滅菌后的MRS培養(yǎng)基中活化,按照菌種說明書上的最適生長溫度培養(yǎng)48 h后傳代2次(活化后的菌液濃度達(dá)1010CFU/mL),再將活化后的菌種接種于滅菌的葡萄汁中培養(yǎng)48 h,使益生菌菌種適應(yīng)葡萄汁中的環(huán)境。培養(yǎng)后的種子液濃度達(dá)到109CFU/mL。

1.2.3 菌種篩選 菌種篩選分初篩和復(fù)篩。初篩主要考慮各菌株在葡萄汁中的發(fā)酵產(chǎn)酸能力和對酚類物質(zhì)的影響。將21株益生菌種子液分別接種于葡萄汁(接種量5%)中,在各自最適生長溫度下發(fā)酵72 h,以發(fā)酵液的總酚含量和pH為考察指標(biāo),從21株益生菌中篩選出總酚含量較未接種益生菌的葡萄汁對照組升高最多、pH較對照組降低最多的益生菌各3株,分別是消化乳桿菌21852、植物乳桿菌21802、短乳桿菌6239、戊糖乳桿菌21798、戊糖乳桿菌21832和發(fā)酵乳桿菌21838,其最適生長溫度均為37 ℃。復(fù)篩主要考慮菌株在葡萄汁中的發(fā)酵能力、耐受性和對感官品質(zhì)的影響。將初篩得到6株菌分別接種于葡萄汁(接種量5%)中,在37 ℃條件下發(fā)酵,每間隔一定時間取樣分析活菌數(shù),結(jié)合感官評定篩選出最終發(fā)酵液中活菌數(shù)最多、感官評分最高的益生菌各1株,進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)配和工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.4 菌種復(fù)配試驗(yàn) 將復(fù)篩得到的兩株益生菌種子液分別按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶0、0∶1的比例,接種于葡萄汁(接種量5%)中,置于37 ℃下發(fā)酵72 h,測定發(fā)酵液活菌數(shù)并進(jìn)行感官評定。篩選出最佳菌種比例后進(jìn)行復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 葡萄汁稀釋倍數(shù) 設(shè)定葡萄汁與水的體積比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、1∶0,接種量5%,37 ℃下發(fā)酵60 h,分別測定其活菌數(shù)并進(jìn)行感官評分。

1.2.5.2 接種量 葡萄汁與水的體積比為2∶1,設(shè)定接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%,37 ℃下發(fā)酵60 h,分別測定其活菌數(shù)并進(jìn)行感官評分。

1.2.5.3 發(fā)酵溫度 葡萄汁與水的體積比為2∶1,接種量5%,分別置于30、34、37、40 ℃條件下發(fā)酵60 h,測定其活菌數(shù)并進(jìn)行感官評分。

1.2.5.4 發(fā)酵時間 葡萄汁與水的體積比為2∶1,接種量5%,發(fā)酵溫度37 ℃,發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60、72、84 h,測定其活菌數(shù)并進(jìn)行感官評分。

1.2.6 益生菌發(fā)酵葡萄汁工藝正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量為自變量,以活菌數(shù)和感官評分為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 最佳發(fā)酵工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design of the optimal fermentation conditions

1.2.7 分析方法 總酚含量采用Folin-酚法[17]測定,以沒食子酸計(jì)。pH的測定采用pH計(jì)法。益生菌活菌數(shù)的測定按照GB 4789.35-2016規(guī)定方法進(jìn)行。

1.2.8 感官評定 參考任婷婷等[18]、郗恩光等[19]的方法,由10名具有專業(yè)背景的老師和同學(xué)組成品評小組,從色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)四個方面進(jìn)行感官評定。評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 不同益生菌發(fā)酵葡萄汁感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of grape juice fermented with different probiotic strains

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做三次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果用SAS 9.2進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

初篩得到的6株益生菌在葡萄汁中的生長曲線如圖1所示。

圖1 不同益生菌在葡萄汁中的生長及發(fā)酵曲線Fig.1 Growth curves of different probiotic strains in grape juice

由圖1可見,初篩所選的6株益生菌在葡萄汁中發(fā)酵72 h后其活菌數(shù)均可達(dá)到108CFU/mL以上,符合益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。其中,植物乳桿菌21802發(fā)酵葡萄汁中活菌數(shù)最高,發(fā)酵72 h時為2.00×109CFU/mL,其他均在109CFU/mL以下。

為了解不同菌株發(fā)酵對葡萄汁感官品質(zhì)的影響,進(jìn)一步對發(fā)酵后的葡萄汁進(jìn)行感官評定,結(jié)果見圖2。

圖2 不同益生菌發(fā)酵的葡萄汁的感官評分Fig.2 Scores of sensory evaluation of grape juices fermented with different probiotic strains注:不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3～圖7。

由圖2可以看出,短乳桿菌6239和消化乳桿菌21852發(fā)酵后的葡萄汁的感官評分顯著高于其它幾種菌發(fā)酵后的葡萄汁,且優(yōu)于未發(fā)酵的葡萄汁(P<0.05),而戊糖乳桿菌21832和戊糖乳桿菌21838發(fā)酵的葡萄汁感官評分顯著低于未發(fā)酵葡萄汁(P<0.05)。綜合考慮活菌數(shù)和感官評分,選擇植物乳桿菌21802(活菌數(shù)最高)和短乳桿菌6239(感官評分最高)作為復(fù)配菌種,進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 菌種復(fù)配試驗(yàn)

為獲得兩株益生菌的適宜復(fù)配比例,以活菌數(shù)和感官評分為指標(biāo),對不同比例植物乳桿菌21802和短乳桿菌6239在葡萄汁中的發(fā)酵情況進(jìn)行了考察,結(jié)果見圖3。

圖3 不同菌種比例發(fā)酵葡萄汁的活菌數(shù)與感官評分Fig.3 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented with different ratio of Lactobacillus plantarum 21082 and Lactobacillus breris 6239

由圖3可以看出,隨著短乳桿菌6239比例的增加,葡萄汁的感官評分逐漸增加,而增大植物乳桿菌21802的比例則有助于活菌數(shù)的增加。這也與初篩時兩株菌在葡萄汁中的表現(xiàn)相一致。當(dāng)植物乳桿菌21802與短乳桿菌6239的比例為1∶2時,葡萄汁的感官評分最高,其活菌數(shù)也達(dá)到最高,繼續(xù)增大植物乳桿菌21802與短乳桿菌6239的比例則造成感官評分的大幅降低。因此確定植物乳桿菌21802與短乳桿菌6239的適宜復(fù)配比例為1∶2。

2.3 復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 葡萄汁稀釋倍數(shù)對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的影響 全葡萄汁含酸量較高,會影響益生菌的生長,而且成本也較高。但稀釋倍數(shù)過高會造成風(fēng)味變淡,影響發(fā)酵葡萄汁的感官品質(zhì)。不同稀釋倍數(shù)對復(fù)合益生菌發(fā)酵葡萄汁的活菌數(shù)及感官評分的影響見圖4。

圖4 不同稀釋倍數(shù)對復(fù)合益生菌協(xié)同 發(fā)酵葡萄汁活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.4 Viable count and sensory evaluation of fermented grape juices with different dilution ratio

由圖4可以看出,當(dāng)葡萄汁與水的比例由1∶3增至2∶1時,益生菌發(fā)酵葡萄汁的感官評分和活菌數(shù)逐漸增加,進(jìn)一步增大葡萄汁的濃度則對活菌數(shù)和感官評分沒有顯著影響(P>0.05),說明葡萄汁與水的比例為2∶1時其營養(yǎng)成分既可滿足益生菌的生長及發(fā)酵需求,同時還可保證益生菌發(fā)酵葡萄汁的風(fēng)味。因此選擇葡萄汁與水的比例2∶1作為葡萄汁的適宜稀釋倍數(shù)。

2.3.2 接種量對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的影響 不同接種量對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的影響見圖5。當(dāng)接種量低于5%時,隨著接種量的增加,發(fā)酵葡萄汁中活菌數(shù)及感官評分均逐漸增高,但當(dāng)接種量超過5%后,進(jìn)一步增大接種量則對活菌數(shù)沒有顯著影響(P>0.05),但感官評分略有降低。因此,接種量以5%左右比較適宜。

圖5 不同接種量對益生菌發(fā)酵葡萄汁 活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.5 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented with different inoculation ratio

2.3.3 發(fā)酵溫度對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的影響 隨著發(fā)酵溫度的升高,益生菌發(fā)酵葡萄汁的活菌數(shù)和感官評分均呈先升高后降低的趨勢。由圖6可見,發(fā)酵溫度為34 ℃時活菌數(shù)和感官評分均為最高,30和40 ℃發(fā)酵時活菌數(shù)最低,這可能是因?yàn)闇囟冗^低,益生菌生長發(fā)酵緩慢,而溫度過高則會造成菌種老化死亡,產(chǎn)生異味,從而造成感官評分降低。與34 ℃相比,37 ℃發(fā)酵葡萄汁的活菌數(shù)略有降低,但感官評分沒有顯著差異(P>0.05)。因此,發(fā)酵溫度以34 ℃左右為宜。

圖6 發(fā)酵溫度對益生菌發(fā)酵葡萄汁 活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.6 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented at different temperature

2.3.4 發(fā)酵時間對復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的影響 圖7所示為不同發(fā)酵時間葡萄汁的活菌數(shù)及感官評分。由圖7可見,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵葡萄汁中活菌數(shù)和感官評分均逐漸增加,至60 h后均達(dá)到穩(wěn)定,進(jìn)一步延長發(fā)酵時間則對活菌數(shù)和感官評分均沒有顯著影響(P>0.05)。因此,發(fā)酵時間以60 h左右為宜。

圖7 發(fā)酵時間對復(fù)合益生菌發(fā)酵葡萄汁 活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.7 Viable count and sensory evaluation of grape juice fermented for different time

2.4 復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

為獲得復(fù)合益生菌發(fā)酵葡萄汁的最佳工藝條件,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定葡萄汁與水的比例為2∶1,選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間3個因素,以活菌數(shù)和感官評分為評價(jià)指標(biāo),進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of grape juice fermented with compound probiotics

由表3可見,影響復(fù)合益生菌發(fā)酵葡萄汁活菌數(shù)的最主要因素是發(fā)酵溫度,其次是接種量,發(fā)酵時間的影響極小;對感官評分的影響也以發(fā)酵溫度為最大,其次是發(fā)酵時間,接種量的影響最小。方差分析結(jié)果(表4)也表明,發(fā)酵溫度對葡萄汁的活菌數(shù)和感官評分有顯著影響(P<0.05),而發(fā)酵溫度和接種量的影響不顯著(P>0.05)。以活菌數(shù)為考察指標(biāo),復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵葡萄汁的最優(yōu)化工藝條件為A3B1C2,而以感官評分為考察指標(biāo)得到的最佳工藝條件為A3B2C2?？紤]到發(fā)酵時間(B)對活菌數(shù)的影響極小(極差為0.04),而方差分析結(jié)果亦不顯著(P>0.05),而發(fā)酵時間(B)對感官評分的影響相對較大(極差為2.77),綜合判定選擇A3B2C2作為復(fù)合益生菌發(fā)酵葡萄汁的最佳工藝,即發(fā)酵溫度為36 ℃、接種量5%,發(fā)酵時間60 h,在此條件下發(fā)酵所得益生菌發(fā)酵葡萄汁的活菌數(shù)為8.98×109CFU/mL,感官評分為91.1分。這一結(jié)果優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道的益生菌發(fā)酵蘋果汁[9]、獼猴桃汁[10]、石榴汁[11]以及枸杞汁[20]在最優(yōu)工藝條件下所達(dá)到的活菌數(shù),說明本研究所篩選益生菌在葡萄汁中具有良好的發(fā)酵特性,適合于益生菌發(fā)酵葡萄汁的生產(chǎn)。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

3 結(jié)論

本研究通過菌種初篩和復(fù)篩,獲得適宜葡萄汁發(fā)酵的植物乳桿菌21802和短乳桿菌6239,并將兩株菌進(jìn)行復(fù)配進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵,其最優(yōu)化工藝條件為:每2體積的葡萄汁加入1體積的水,植物乳桿菌21802與短乳桿菌6239菌種比例為1∶2,接種量5%,發(fā)酵溫度36 ℃,發(fā)酵時間60 h。此條件下發(fā)酵所得益生菌發(fā)酵葡萄汁活菌數(shù)可達(dá)到8.98×109CFU/mL,感官評分為91.1分。