鯽魚皮膠原蛋白理化性質(zhì)及自組裝行為研究

繆 楠,秦倩倩,周 穎,吳瓊英,賈俊強(qiáng)

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212018) (2.江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212004)

膠原蛋白是生物體中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,對(duì)機(jī)體細(xì)胞的遷移、分化、繁殖以及機(jī)體組織的形成和功能發(fā)揮等均有重要作用.膠原蛋白類型繁多,主要存在于動(dòng)物的皮、骨和肌腱等結(jié)締組織中[1].其中,I型膠原蛋白具有較弱的抗原性和良好的生物相溶性及生物降解特性，被廣泛用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)材料、組織工程等領(lǐng)域[2].目前，膠原蛋白制品主要來源于陸生動(dòng)物,但由于瘋牛病和口蹄疫等流行病的發(fā)生,人們逐漸將膠原蛋白的來源轉(zhuǎn)向水生及兩棲類生物[3].與陸生動(dòng)物膠原蛋白相比,魚類膠原蛋白的熱穩(wěn)定性和生物力學(xué)性能較差[4],限制了魚類膠原蛋白的進(jìn)一步利用.自組裝能使膠原分子單體通過大量非共價(jià)鍵弱相互作用力的協(xié)同效應(yīng)進(jìn)行有序排列,形成具有交錯(cuò)條紋結(jié)構(gòu)的膠原纖維,從而改善膠原纖維的生物力學(xué)性能[5].

鯽魚(Carassiusauratus)又名喜頭,屬硬骨魚綱,鯉形目,鯉科,鯽屬,為我國(guó)主要養(yǎng)殖的淡水魚之一.現(xiàn)代研究表明,魚皮作為水產(chǎn)加工中的副產(chǎn)物,其膠原蛋白含量占總蛋白含量的80%以上[6],是一種潛在的膠原蛋白資源.與其他淡水魚相比,鯽魚具有價(jià)格低廉、體內(nèi)膠原蛋白含量豐富等優(yōu)點(diǎn)[7],因此具有良好的開發(fā)前景.文中以鯽魚皮為原料,分別利用酸法和酶法制備酸溶性和酶溶性膠原蛋白,對(duì)膠原蛋白的氨基酸組成、分子量、紫外光譜、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及自組裝行為進(jìn)行了初步研究,以期為鯽魚皮膠原蛋白的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

新鮮鯽魚購(gòu)于鎮(zhèn)江市萬達(dá)廣場(chǎng)蘇果超市.在仔細(xì)分離魚鱗后，將魚皮從魚肉上剝離,去除魚皮上的殘余魚肉.隨后將魚皮分次充分洗滌后切成0.5 cm×0.5 cm左右小片,淋干后-20 ℃凍藏.NaOH、NaCl、乙酸等化學(xué)試劑均為國(guó)藥分析純;胃蛋白酶(3 000 U/mg)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;蛋白Marker(170kDa)購(gòu)于Thermo Fisher公司;考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白的提取

膠原蛋白提取法主要有酸溶法和酶溶法．文中膠原蛋白的提取參考文獻(xiàn)[8]的方法并略作改動(dòng).首先對(duì)化凍后脫脂、除雜蛋白的魚皮進(jìn)行乙酸浸提，得到酸溶性膠原蛋白，繼續(xù)對(duì)不可溶的殘?jiān)M(jìn)行胃蛋白酶酶解，得到酶溶性膠原蛋白．

酸溶性膠原蛋白:蒸餾水洗滌魚皮至洗滌液無味后用0.5 mol/L的乙酸溶液于4 ℃下浸提48 h,浸提期間不間斷攪拌，5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min,收集上清液.添加NaCl至終濃度0.9 mol/L,收集酸溶性膠原蛋白,0.5 mol/L乙酸復(fù)溶,0.01 mol/L乙酸透析備用.

酶溶性膠原蛋白:將上述離心后得到的沉淀用清水漂洗至漂洗液中性,用含有 0.5%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸4 ℃浸提沉淀48 h,浸提期間不間斷攪拌，5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min,收集上清液.添加NaCl至終濃度0.9 mol/L,收集酶溶性膠原蛋白,0.5 mol/L乙酸復(fù)溶,0.01 mol/L乙酸透析備用.

1.2.2 氨基酸測(cè)定

稱取15.2 mg膠原蛋白樣品,用7 mL濃度為6 mol/L的HCl溶解,N2保護(hù),110 ℃酸水解22 h,冷卻后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶,定容.取0.2 mL酸水解后的樣品用55 ℃N2吹干,加入1 mL蒸餾水再烘干,反復(fù)3次.用1.2 mL以去離子水配制的0.02 mol/L HCl充分溶解,混勻.用 0.45 μm濾膜過濾,進(jìn)樣20 μL,使用L-8900氨基酸分析儀(日本日立公司)測(cè)試.

1.2.3 SDS-PAGE

采用8%分離膠,5%濃縮膠的SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色，用冰醋酸-乙醇為脫色液進(jìn)行脫色.

1.2.4 紫外光譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 mg膠原蛋白樣品溶于2 mL 0.01 mol/L乙酸中,離心后取上清液在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描.

1.2.5 近紅外拉曼光譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱取酶溶性和酸溶性膠原蛋白樣品各2 mg,置于QE65Pro型拉曼光譜儀下進(jìn)行掃描,激發(fā)波長(zhǎng)785 nm,采樣積分時(shí)間10 s,平均掃描3次,掃描范圍0～2 700 cm-1.使用OPUS5.5軟件進(jìn)行光譜擬合.

1.2.6 膠原蛋白自組裝行為觀察

自組裝方法參考文獻(xiàn)[9]并略作改動(dòng),以魚皮酸溶性、酶溶性膠原蛋白溶液為研究對(duì)象,自組裝前保持酸溶性、酶溶性膠原蛋白溶液處于冰浴中.構(gòu)建2 mL自組裝反應(yīng)體系,初始參數(shù)為:NaCl濃度200 mmol/L,pH 7.21,膠原蛋白濃度1 mg/mL,將反應(yīng)液混合均勻后立即置于20 ℃水浴中進(jìn)行自組裝,每隔30 s在紫外波長(zhǎng)313 nm下測(cè)定吸光度,自組裝時(shí)間1 h.以自組裝時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制自組裝曲線.

1.2.7 不同因素對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響

以魚皮酸溶性、酶溶性膠原蛋白為研究對(duì)象,分別研究膠原蛋白質(zhì)量濃度、pH、NaCl濃度和溫度對(duì)自組裝行為的影響．

(1) 膠原蛋白質(zhì)量濃度對(duì)自組裝行為的影響

在其他因素(pH、NaCl濃度、溫度)不變的情況下,研究膠原蛋白質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.5、1、2.1 mg/mL,其中酶溶性膠原蛋白濃度將2.1 mg/mL改為1.3mg/mL)對(duì)自組裝行為的影響,分別繪制自組裝動(dòng)力學(xué)曲線.

(2) pH對(duì)自組裝行為的影響

在其他因素(膠原蛋白質(zhì)量濃度、NaCl濃度、溫度)不變的情況下,研究pH(4.1、6.8、7.2、9.6)對(duì)自組裝行為的影響,分別繪制自組裝動(dòng)力學(xué)曲線.

(3) NaCl濃度對(duì)自組裝行為的影響

在其他因素(膠原蛋白質(zhì)量濃度、pH、溫度)不變的情況下,研究NaCl濃度(0、60、120、200、400、600、800 mmol/L)對(duì)自組裝行為的影響,分別繪制自組裝動(dòng)力學(xué)曲線.

(4) 溫度對(duì)自組裝行為的影響

在其他因素(膠原蛋白質(zhì)量濃度、pH、NaCl濃度)不變的情況下,研究溫度(10、20、35、50、70 ℃)對(duì)自組裝行為的影響,分別繪制自組裝動(dòng)力學(xué)曲線.

1.2.8 自組裝過程中微觀結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)自組裝曲線,分別選取魚皮酸溶性和酶溶性膠原蛋白自組裝過程中成核期、快速成長(zhǎng)期和平衡期的自組裝材料，置于-55 ℃的冷井中快速冷凍20 min.使用CM1520型冰凍切片機(jī)將冷凍后的自組裝材料進(jìn)行切片,切片厚度10 μm,將切片置于載玻片上,常溫下陰干樣品中水分.利用考馬斯亮藍(lán)R-250組織染色法對(duì)不同階段的自組裝材料染色,染色時(shí)間3 min,5%乙醇溶液脫色5 min.常溫陰干后置于E100型光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚皮膠原蛋白的提取

使用1.2.1方法提取的酸溶性膠原蛋白、酶溶性膠原蛋白經(jīng)真空冷凍干燥后皆為白色細(xì)孔海綿狀結(jié)構(gòu),蓬松質(zhì)軟且不分散.樣品中蛋白產(chǎn)量分別為(38.32±0.61)%和(13.81±0.32)%.鯽魚皮膠原蛋白提取率遠(yuǎn)高于同類文獻(xiàn)中豬皮的提取率[10],說明魚皮膠原蛋白更易溶于乙酸溶液中.這可能是由于魚皮膠原蛋白的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)與排列相較于哺乳動(dòng)物而言更疏松,有利于膠原蛋白自組裝動(dòng)力學(xué)的研究.

2.2 氨基酸分析

由氨基酸組成(表1)分析表明,酸溶性、酶溶性膠原蛋白的氨基酸組成基本差異不明顯,主要氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和特征性的羥脯氨酸.其中甘氨酸約占氨基酸總量的33%,且脯氨酸含量較高,未檢測(cè)出色氨酸,符合I型膠原蛋白氨基酸比例及其經(jīng)典三肽Gly-X-Y結(jié)構(gòu)[1,11](X多為脯氨酸,Y多為羥脯氨酸).

表1 鯽魚皮膠原蛋白樣品中氨基酸組成分析Table 1 Amino acid composition of collagens

注:N表示此氨基酸含量極低,未能檢測(cè)出.

2.3 SDS-PAGE分析

酸溶性、酶溶性膠原蛋白樣品的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜(圖1)結(jié)果表明:(1) 兩種膠原蛋白皆由α1、α2兩條約120kDa左右的輕鏈和一條約200kDa左右的β重鏈組成,α1含量約為α2的兩倍,符合典型Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征,與膠原蛋白肽鏈氨基酸殘基數(shù)1014基本相符;(2) 兩種樣品條帶分布基本一致.鯽魚皮膠原蛋白與哺乳動(dòng)物膠原蛋白最小單位分子量一致,可能具有相似或相同的蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)[11].

1：酶溶性膠原蛋白;2：酸溶性膠原蛋白;3：蛋白Marker圖1 鯽魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of collagens fromCarassiusauratus skin

2.4 紫外光譜分析

膠原蛋白中芳香烴類氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸含量較低且不含色氨酸,其主要生色基團(tuán)集中在羰基、羧基和肽鍵上.紫外光譜分析(圖2)結(jié)果表明，兩種膠原蛋白紫外主要吸收在215～220 nm區(qū)間,酶溶性、酸溶性膠原蛋白在218 nm附近具有強(qiáng)烈吸收.文獻(xiàn)[12]結(jié)果表明，鱈魚皮膠原蛋白在220 nm處具有強(qiáng)烈的吸收.文獻(xiàn)[13]結(jié)果表明，鯉魚皮膠原蛋白在233 nm處具有特征性吸收峰.這可能是由于鰱魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)更緊密,其內(nèi)基團(tuán)氫鍵作用更強(qiáng)烈引起的光譜藍(lán)移.從圖2可知,酸溶性、酶溶性膠原蛋白在280 nm處皆有較弱的吸收峰,說明兩種膠原蛋白都含有少量的芳香族氨基酸[14].

圖2 鯽魚皮膠原蛋白的紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of collagens fromCarassiusauratus skin

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

熒光干擾使膠原蛋白的拉曼信號(hào)偏弱,根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法,對(duì)原始拉曼光譜進(jìn)行歸一化處理(利用1 004 cm-1下苯丙氨酸的吸收峰進(jìn)行歸一化處理)，得到圖3.其中,酰胺Ⅰ帶(1 610～1 700 cm-1)包含蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)信息且較為常用,在1 665 cm-1獲得明顯的特征峰,這與文獻(xiàn)[16]的結(jié)果類似.對(duì)1 610～1 700 cm-1的處理光譜進(jìn)行子峰擬合，得到圖4.利用擬合子峰計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比，結(jié)果見表2.根據(jù)表2可以得出以下結(jié)論:(1) β-折疊是膠原蛋白的經(jīng)典構(gòu)成之一,而干樣中α-螺旋含量較低,這可能是由于高含量β-折疊可以使得宏觀力學(xué)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)固；(2) 酶溶性膠原蛋白的β-折疊含量略高于酸溶性膠原蛋白,這可能是由于其含有更高的甘氨酸所致,甘氨酸羰基氧與脯氨酸的酰胺氫可以形成穩(wěn)固的氫鍵,因此高含量的甘氨酸能穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu).拉曼光譜分析表明,鯽魚皮膠原蛋白與其他哺乳動(dòng)物膠原蛋白具有相類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)[16],但鯽魚皮膠原結(jié)構(gòu)更為疏松,相較于哺乳動(dòng)物源膠原更易被利用于水介導(dǎo)的自組裝.

圖3 歸一化后鯽魚皮膠原蛋白的拉曼光譜Fig.3 Normalized Raman spectrums of collagens fromCarassiusauratus skin

圖4 鯽魚皮膠原蛋白的拉曼擬合光譜Fig.4 Fitted Raman Spectrum of the collagensfrom Carassiusauratus skin

表2 鯽魚皮膠原蛋白各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Different secondary structure contents of the collagens from Carassiusauratus skin

注1:不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05).

注2:4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)的劃歸區(qū)間:1 645～1 660 cm-1為α-螺旋,1 660～1 670 cm-1為無規(guī)卷曲,1 665～1 680 cm-1為β-折疊,1 640～1 645 cm-1和1 680～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角.

2.6 不同因素對(duì)膠原蛋白體外自組裝行為的影響

2.6.1 膠原蛋白質(zhì)量濃度對(duì)膠原蛋白自組裝行為的影響

膠原蛋白濃度對(duì)自組裝啟動(dòng)具有極其重要的作用.從圖5(a)可以看出,酸溶性膠原蛋白自0.5 mg/mL起,自組裝效果比較明顯.根據(jù)快速生長(zhǎng)期斜率可以發(fā)現(xiàn),膠原蛋白濃度越高,自組裝越快.另外,0.2 mg/mL以下膠原蛋白的自組裝效果較差，說明自組裝成核需要一定濃度的膠原蛋白才能啟動(dòng)自組裝,這與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果一致.在相同膠原蛋白濃度下,酶溶性膠原蛋白相較于酸溶性膠原蛋白自組裝更快,成核期更短,平衡期在313 nm下的吸光值較低,說明酸溶性膠原蛋白形成的三螺旋結(jié)構(gòu)含量更高.從圖5(b)可以看出,酶溶性膠原蛋白膠原濃度自0.2 mg/mL起,自組裝效果比較明顯，且膠原蛋白濃度越高,自組裝越快,這與酸溶性膠原蛋白自組裝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.結(jié)果表明,膠原蛋白濃度對(duì)自組裝成核期有決定性作用,酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的自組裝基本單位結(jié)構(gòu)上略有不同.

圖5 膠原蛋白濃度對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響Fig.5 Effect of the collagen concentration on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

2.6.2 pH對(duì)膠原蛋白自組裝行為的影響

圖6為不同pH對(duì)酸溶性、堿溶性膠原蛋白的自組裝行為的影響.圖6(a)為不同pH條件下酸溶性膠原蛋白的自組裝行為.pH=4.06時(shí),酸溶性膠原蛋白自組裝效果較弱且無明顯S型曲線,結(jié)合pH=6.83下成核期較長(zhǎng)的現(xiàn)象,說明較高濃度的乙酸對(duì)自組裝有抑制作用,這可能是由于游離羧基與膠原蛋白的疏水基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)引起的.pH=7.21時(shí)自組裝速率最高,可能是此pH與酸溶性膠原蛋白的等電點(diǎn)相近,反應(yīng)體系內(nèi)凈電荷趨于零,膠原分子之間的靜電電荷排斥減少,更利于自組裝.而在pH=9.62時(shí),自組裝基本沒有發(fā)生,這可能由于酸溶性膠原蛋白在強(qiáng)堿性條件下會(huì)發(fā)生高級(jí)結(jié)構(gòu)消失以及一定程度的降解.綜上所述,酸溶性鯽魚皮膠原蛋白在弱堿性條件下有最優(yōu)的自組裝效果.

圖6 pH值對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響Fig.6 Effect of the pH value on self-assembly behaviorof collagens from Carassiusauratus skin

圖6(b)為不同pH下酶溶性膠原蛋白的自組裝行為.在pH=4.06時(shí),酶溶性膠原蛋白自組裝行為表現(xiàn)與酸溶性膠原蛋白基本一致,說明一定濃度的乙酸對(duì)兩種膠原蛋白自組裝皆有一定抑制作用.pH=6.83和pH=7.21時(shí)，酶溶性膠原蛋白除卻自組裝速率較高外,相較于酸溶性膠原蛋白,兩種膠原蛋白自組裝曲線皆有較明顯S型.而酶溶性膠原蛋白在pH=9.62時(shí)依然有一定程度的自組裝,這可能是因?yàn)槊溉苄阅z原蛋白的等電點(diǎn)比酸溶性膠原蛋白略高,因此在較高pH條件下依然可以進(jìn)行自組裝.

2.6.3 NaCl濃度對(duì)膠原蛋白自組裝行為的影響

NaCl濃度對(duì)膠原蛋白自組裝行為具有一定的提升和加速作用(圖7).圖7(a)表明無NaCl影響下,酸溶性膠原蛋白依然有一定的自組裝行為,這可能是弱堿性條件下膠原蛋白分子本身的自聚集現(xiàn)象.根據(jù)圖7(a)的自組裝曲線可知,自60 mmol/L開始,酸溶性膠原蛋白有較明顯的自組裝行為,濃度為200 mmol/L時(shí)膠原蛋白自組裝程度開始達(dá)到飽和.繼續(xù)提高NaCl濃度并不會(huì)提高酸溶性膠原蛋白自組裝的飽和度,但是會(huì)延長(zhǎng)成核期,且對(duì)快速生長(zhǎng)期的組裝速率沒有顯著影響.這可能是由于較高濃度的NaCl對(duì)膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)有一定解鏈作用并使反應(yīng)體系再次達(dá)到某種穩(wěn)態(tài)后纖維才會(huì)快速聚合.當(dāng)NaCl濃度達(dá)到800 mmol/L時(shí),酸溶性膠原蛋白不發(fā)生自組裝行為,說明高濃度鹽會(huì)使三螺旋結(jié)構(gòu)不可逆性解鏈,使得自組裝行為不會(huì)發(fā)生.

圖7 NaCl濃度對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響Fig.7 Effect of the NaCl concentration on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

圖7(a)和圖7(b)表明，NaCl濃度對(duì)兩種膠原自組裝影響基本一致,而酶溶性膠原蛋白自組裝速率在相同NaCl濃度下遠(yuǎn)高于酸溶性膠原蛋白,且在600 mmol/L濃度下不進(jìn)行自組裝,說明酶溶性膠原蛋白基本組裝單位結(jié)構(gòu)更小,所需解鏈的NaCl濃度相較酸溶性膠原蛋白而言更低.

2.6.4 環(huán)境溫度對(duì)膠原蛋白自組裝行為的影響

圖8(a)的結(jié)果表明，酸溶性膠原蛋白即使在10 ℃下依然且有較好的自組裝行為，當(dāng)溫度達(dá)到20 ℃時(shí),自組裝效果最佳,而35 ℃下自組裝程度則略低于前者,說明有部分膠原蛋白未能參與自組裝,由此可猜測(cè)酸溶性膠原蛋白熱變性溫度略低于35 ℃.從50 ℃開始酸溶性膠原蛋白發(fā)生完全變性,不能進(jìn)行正常自組裝,其成核期一段吸光度的上升是由于傳熱不均導(dǎo)致的.圖8(b)的結(jié)果表明，20 ℃下酶溶性膠原蛋白自組裝達(dá)到最優(yōu)效果,其熱變性溫度與酸溶性膠原蛋白相似,且當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到50 ℃以上時(shí),酶溶性膠原蛋白也不能進(jìn)行自組裝.

圖8 溫度對(duì)鯽魚皮膠原蛋白自組裝行為的影響Fig.8 Effect of the temperature on self-assemblybehavior of collagens from Carassiusauratus skin

2.7 微觀結(jié)構(gòu)

對(duì)膠原蛋白及其自組裝材料進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，通常以掃描電鏡法、透射電鏡法、原子力顯微鏡法以及X衍射法等居多.用這類方法獲得的膠原蛋白纖維的微觀結(jié)構(gòu)清楚、精細(xì),其精度能觀察到纖維的D周期[17].然而實(shí)驗(yàn)成本較高,對(duì)解決大量樣本的微觀狀態(tài)或自組裝材料低分辨率微觀狀態(tài)等問題有大材小用之嫌.文中通過簡(jiǎn)化考馬斯亮藍(lán)R-250組織染色法對(duì)膠原蛋白不同時(shí)期的自組裝材料進(jìn)行冷凍切片后染色處理并置于光學(xué)顯微鏡400倍下觀察.從圖9可看出,成核期內(nèi)酶溶性膠原蛋白的膠原纖維相較于酸溶性膠原蛋白更長(zhǎng),且在同等條件影響下酸溶性膠原蛋白的成核期略長(zhǎng)于酶溶性膠原蛋白,可能是因?yàn)樗崛苄阅z原蛋白成核需要更穩(wěn)定的三螺旋鏈;快速成長(zhǎng)期內(nèi),酶溶性膠原蛋白形成的自組裝材料更為細(xì)密,纖維直徑遠(yuǎn)低于相同時(shí)期的酸溶性膠原蛋白,且相同自組裝條件下酶溶性膠原蛋白自組裝速率高于酸溶性膠原蛋白,因此自組裝速率可能與成核期膠原纖維長(zhǎng)度有關(guān);當(dāng)自組裝材料進(jìn)入平衡期時(shí),不同膠原纖維團(tuán)之間會(huì)通過水介導(dǎo)的氫鍵以及其他分子間作用快速“搭橋”形成更粗的高級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)以及部分云狀結(jié)構(gòu)直至凝膠力學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[18].

圖9 鯽魚皮膠原蛋白自組裝不同時(shí)期微觀結(jié)構(gòu)Fig.9 Carassius carp collagen microstructure at different self-assembly stages

3 結(jié)論

(1) 以鯽魚皮為原料提取酸溶性、酶溶性膠原蛋白，其產(chǎn)量分別為38.32%和13.81%。兩種膠原蛋白富含甘氨酸，在218 nm處有特征吸收峰，呈Ⅰ型膠原蛋白特征；兩種膠原蛋白具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有最高的β-折疊和最低的α-螺旋.

(2) 鯽魚皮酸溶性、酶溶性膠原蛋白的自組裝行為分別受到膠原蛋白濃度、pH值、NaCl濃度和溫度等4個(gè)因素的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了酸溶性膠原蛋白自組裝條件為：膠原蛋白濃度2.1 mg/mL、pH 7.2、NaCl濃度200～600 mmol/L、溫度20 ℃；酶溶性膠原蛋白自組裝條件為：膠原蛋白濃度1.3 mg/mL、pH 7.2、NaCl濃度200～400 mmol/L、溫度20 ℃.