咽拭子新型冠狀病毒核酸檢測的臨床價值

李 佳，李 霖，李春輝，尹 路，胡 霞，陽 瑤，盛 懿，王愛民

(1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院急診科,湖南 長沙 410008； 2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)院感染控制中心,湖南 長沙 410008； 3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院急診科,北京 100730)

2019年12月底湖北省武漢市暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)[1]，之后疫情在中國迅速發(fā)展，截至2020年3月5日我國共確診80 565例患者，累計死亡3 015例。近日國內(nèi)疫情雖有所緩和，但仍未完全消除。隨著復(fù)工人數(shù)的增長，以及境外輸入性病例數(shù)的增多，如何嚴(yán)防疫情再度播散是當(dāng)下亟待解決的問題，而盡早識別并隔離感染患者則是控制疫情的關(guān)鍵所在。COVID-19患者肺部影像學(xué)有一定特異性，湖北省一度將典型肺部影像學(xué)特征作為臨床診斷依據(jù)，然而對于湖北省外的患者，單從影像學(xué)并不足以判斷是否感染[2]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)核酸檢測是目前確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)。由于該病毒為單鏈RNA結(jié)構(gòu)，本身具有不穩(wěn)定性以及病毒分布的特殊性等，使得臨床采集標(biāo)本檢測容易出現(xiàn)假陰性的情況[3-4]。

COVID-19常見臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和/或呼吸道癥狀，早期實驗室檢查外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)正?；驕p少，多數(shù)患者C反應(yīng)蛋白升高，降鈣素原正常。肺部CT早期呈多發(fā)磨玻璃及小斑片影，以肺外帶明顯，嚴(yán)重者可發(fā)展為肺實變，縱膈淋巴結(jié)及胸腔積液少見[2,5]，存在無癥狀的隱性感染患者[6]。目前，國內(nèi)各醫(yī)院發(fā)熱門診主要通過采集鼻咽拭子、咽拭子進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，該方法操作簡便，取樣時間短，臨床操作效率高，但該取樣方法所得核酸檢測靈敏度如何尚未見報道。本研究通過回顧性總結(jié)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院28例確診病例的臨床資料、病毒核酸取樣次數(shù)、取樣方法及檢測結(jié)果，分析并進(jìn)一步評價鼻咽拭子、咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測對診斷COVID-19的臨床價值，為臨床鑒別診斷COVID-19提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院收治的28例COVID-19患者，全部符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[7]中COVID-19確診病例診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 臨床信息收集 28例COVID-19確診患者均在入院第1天收集流行病學(xué)資料、血常規(guī)及肺部CT等臨床信息。肺部CT平掃由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院放射科完成，由放射科主任醫(yī)師統(tǒng)一審核診斷報告。

鼻咽拭子、咽拭子取樣材料均為聚丙烯纖維頭的可折斷塑料桿拭子。取樣方法為，(1)咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗菌藥物引起過敏)，被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次；(2)鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉(zhuǎn)一周(如遇反射性咳嗽，應(yīng)停留片刻)，然后緩緩取出拭子。采樣后迅速將拭子頭折斷并浸入無核酶污染含2 mL等滲鹽溶液的離心(eppendorf, EP)管中，旋閉管蓋并獨立包裝于帶密封條的塑料袋中，于15 min～2 h內(nèi)送入檢測實驗室。以上操作由經(jīng)過生物安全培訓(xùn)并考核合格的主治醫(yī)師進(jìn)行。部分咽拭子病毒核酸檢測由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科實驗室承擔(dān)，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行樣本RNA檢測。

1.3 器材 熒光定量PCR儀型號為ABI Q5(美國Thermofisher ABI)，SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒由江蘇碩世生物科技股份有限公司提供，病毒核酸提取、擴(kuò)增步驟以及結(jié)果判讀均按試劑盒說明書進(jìn)行。試劑盒所針對的靶標(biāo)區(qū)域為SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab, ORF1ab)及核殼蛋白(nucleocapsid protein, N)。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床信息

2.1.1 基本信息及流行病史 COVID-19患者平均年齡為(43.78±14.46)歲；男性20例，女性8例；8例患有基礎(chǔ)疾病，13例有武漢/湖北旅居史，4例有與COVID-19確診患者密切接觸史。見表1。

表1 28例COVID-19確診患者基礎(chǔ)疾病情況和流行病史

2.1.2 臨床癥狀 COVID-19患者臨床表現(xiàn)以發(fā)熱(22例，78.57%)、咳嗽(15例，53.57%)為最常見，咳嗽以干咳為主，少量咳痰。極少有全身酸痛、頭痛等流感樣癥狀。見表2。

表2 28例COVID-19確診患者臨床癥狀

2.1.3 實驗室檢查 71.43%的患者白細(xì)胞計數(shù)在正常范圍內(nèi)，而淋巴細(xì)胞降低(15例，53.57%)、C反應(yīng)蛋白升高[16例，(33.12±31.68)mg/L]、乳酸脫氫酶升高[22例，(259.4±95.78)U/L]常見。共收集22例患者心肌酶學(xué)以及肝、腎功能檢測結(jié)果，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白升高各2例，分別為(301.65±128.48)、(34.05±3.61)、(152.95±62.86)U/L；總膽紅素升高1例，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均升高2例，尿素氮、肌酐升高各1例。收集13例患者降鈣素原檢測結(jié)果，其中8例小于0.05 ng/mL，1例患者輕度升高(0.54 ng/mL)。血常規(guī)結(jié)果見表3。

表3 28例COVID-19確診患者血常規(guī)結(jié)果

2.1.4 影像學(xué)資料 確診患者的肺部CT影像學(xué)特征均表現(xiàn)為胸膜下分布，以雙側(cè)、多發(fā)(85.18%)，磨玻璃影(92.59%)、斑片影(70.37%)多見，縱膈淋巴結(jié)腫大及胸腔積液征少見。見表4。部分患者肺部CT影像學(xué)結(jié)果見圖1。

表4 27例COVID-19確診患者肺部CT影像學(xué)檢查結(jié)果

2.2 COVID-19確診病例病毒核酸檢測確診方式及取樣次數(shù)

2.2.1 確診方式及發(fā)病至確診時間 28例確診病例中，咽拭子采樣26例(92.86%)，誘導(dǎo)排痰2例(7.14%)，經(jīng)鼻咽拭子、咽拭子、痰標(biāo)本RT-PCR確診27例(96.43%)，痰標(biāo)本NGS測序確診1例(3.57%)。發(fā)病至確診的中位時間為5.5 d，發(fā)病日數(shù)與確診例數(shù)關(guān)系見圖2。

A：女性，62歲，發(fā)熱、咳嗽10 d以上，經(jīng)外院2次鼻咽拭子及本院1次咽拭子SARS-CoV-2檢測均陰性，于發(fā)病第13天經(jīng)誘導(dǎo)排痰后對其痰標(biāo)本行下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology,NGS)檢測SARS-CoV-2陽性；B：男性，29歲，發(fā)熱、咳嗽6 d，經(jīng)省疾病預(yù)防控制中心(疾控中心)2次及本院2次咽拭子SARS-CoV-2檢測均陰性，于發(fā)病第9天經(jīng)誘導(dǎo)排痰后經(jīng)省疾控中心RT-PCR檢測痰標(biāo)本陽性；C：男性，64歲，反復(fù)胸悶、氣促1個月以上，咳嗽1周，本院4次咽拭子SARS-CoV-2檢測均陰性，于發(fā)病第25天，第5次同時采集的鼻咽拭子、咽拭子樣本，經(jīng)省疾控中心檢測，其咽拭子樣本陰性，鼻咽拭子樣本陽性確診；D：女性，51歲，發(fā)熱3 d，肺部CT影像學(xué)結(jié)果僅少許條索灶，于入院當(dāng)天首次咽拭子SARS-CoV-2 RT-PCR檢測確診。

病例A發(fā)病第12天首次檢測確診；病例B發(fā)病第13 天，第4次檢測確診；病例C發(fā)病第14天首次檢測確診；病例D發(fā)病第17天首次檢測確診；病例E發(fā)病第25天，第5次檢測確診。

2.2.2 發(fā)病至確診核酸檢測次數(shù) 首次采集標(biāo)本SARS-CoV-2檢測陽性者18例(64.29%)，首次可疑陽性1例；首次陰性(包括可疑陽性)，第二次采集陽性者5例(17.86%)；前兩次采集陰性，第三次采集陽性者2例(7.14%)；經(jīng)四次檢測陽性者1例(3.57%)；經(jīng)五次檢測后陽性者2例(7.14%)。見圖3。

圖3 經(jīng)第N次采集標(biāo)本得以確診的患者占總確診人數(shù)的百分比

3 討論

目前，COVID-19疫情在中國政府強(qiáng)有力的控制下，全國已進(jìn)入治愈人數(shù)超確診人數(shù)的關(guān)鍵時期，但各地仍有少數(shù)治愈出院后，復(fù)診發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測再次陽性的病例報道[8]。隨著社會各行各業(yè)逐漸復(fù)工，以及境外輸入性病例的增加，疫情防控仍存在較大壓力。本院28例COVID-19確診病例中以輕癥為主，中年、男性居多；臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、干咳常見；實驗室檢查白細(xì)胞計數(shù)正常居多，而淋巴細(xì)胞計數(shù)降低、C反應(yīng)蛋白升高、乳酸脫氫酶升高多見；肺部影像學(xué)表現(xiàn)以雙肺、多發(fā)、胸膜下、磨玻璃影及斑片狀影為主。上述表現(xiàn)與其他非湖北省病例的文獻(xiàn)報道[9-10]基本一致。然而僅依靠患者相關(guān)癥狀、實驗室及影像學(xué)檢查[2,5]，有時較難與其他病毒感染相鑒別，SARS-CoV-2核酸檢測仍是確診COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)。本院28例確診病例中，普通咽拭子首次確診率并不理想。臨床對于有明確暴露史的患者有絕對的警惕性，而本院確診病例中有相當(dāng)比例的患者并無明確暴露史，甚至肺部CT也僅有“慢性炎癥”表現(xiàn)，給臨床診斷帶來了巨大挑戰(zhàn)，因此，如何提高確診率是目前亟待解決的問題。

目前，造成SARS-CoV-2核酸檢測假陰性結(jié)果的原因主要有以下幾點：(1)SARS-CoV-2為RNA單鏈結(jié)構(gòu)，不如DNA雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。(2)病毒受體主要分布在下呼吸道，口腔及鼻咽部病毒含量相對較低，且大部分患者僅有干咳癥狀。實際工作中，考慮到臨床操作的簡便性及患者的耐受性，急診發(fā)熱門診對疑似患者首選咽拭子進(jìn)行排查。本文確診病例中，92.86%經(jīng)咽拭子取樣。標(biāo)準(zhǔn)的取樣流程要求咽拭子在取樣部位旋轉(zhuǎn)，并停留15～30 s，但臨床標(biāo)本采集過程中由于部分患者不耐受，導(dǎo)致咽拭子無法在采集部位停留足夠長的時間；還有少數(shù)患者在咽拭子取樣過程中出現(xiàn)干嘔現(xiàn)象，導(dǎo)致采樣拭子觸碰到口腔內(nèi)其他含唾液的部位，而唾液中含大量RNA酶，有可能造成病毒RNA降解。(3)患者的病情輕重程度及病程的長短可能影響病毒在體內(nèi)的分布。報道[2]顯示，隨著病程的延長，患者咽拭子SARS-CoV-2與肛拭子SARS-CoV-2檢出率呈此消彼長的趨勢。

為提高SARS-CoV-2檢測陽性率需注意以下幾點：(1)防止標(biāo)本中病毒RNA降解。標(biāo)本采集過程中應(yīng)避免觸碰到除患者扁桃體及咽喉壁以外的其他部位，采集后應(yīng)于2～4 h內(nèi)盡快將標(biāo)本送至實驗室；2℃～8℃保存條件下轉(zhuǎn)運的標(biāo)本運送時間不得超過72 h，若轉(zhuǎn)運超過72 h的標(biāo)本則應(yīng)低于-70℃保存。(2)多部位同時采樣。本研究中部分患者多次鼻咽拭子、咽拭子檢測均陰性，痰檢陽性。病毒核酸檢測陽性率最高的標(biāo)本為肺泡灌洗液，其次依序為誘導(dǎo)深部咳痰標(biāo)本、鼻咽拭子、咽拭子，然而對于無氣管插管患者不主張進(jìn)行肺泡灌洗。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》[11]標(biāo)本采集優(yōu)選順序為鼻咽拭子、咽拭子、痰，可同時采集多部位標(biāo)本以提高陽性率。感染患者糞便標(biāo)本中也可檢測出病毒，已有學(xué)者提出糞便取樣方便、標(biāo)本量大，呼吁重視糞便檢測SARS-CoV-2的臨床價值[12-13]。(3)多部門同時檢測。多個實驗室同時檢測也是降低核酸檢測假陰性的方法之一。不同實驗室RT-PCR檢測SARS-CoV-2的引物、探針設(shè)計可能不同，針對的靶標(biāo)(ORF1ab、N或E結(jié)構(gòu)蛋白)組合也不盡相同[14]，多個實驗室同時檢測能有效防止因檢測試劑及操作人員等因素造成的假陰性結(jié)果。此外，已有報道[6]證實，該病毒存在變異，不同檢測方法，尤其是進(jìn)行核酸測序，是降低核酸檢測假陰性的可靠手段。本研究中部分病例標(biāo)本在本院檢驗科實驗室進(jìn)行檢測的同時也將標(biāo)本送至其他實驗室行RT-PCR甚至核酸測序檢測。(4)檢測血清新型冠狀病毒抗體。研究[15]報道，對一組入院治療的患者連續(xù)10 d監(jiān)測其體內(nèi)病毒抗體免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的滴度，發(fā)現(xiàn)在入院當(dāng)天患者的IgM和IgG抗體滴度表達(dá)均處于低水平甚至檢測不到，而入院后第5 天幾乎所有患者都出現(xiàn)了以上兩種抗體表達(dá)的增高，IgM陽性率從50%(8/16)增至81%(13/16)，而IgG從81%(13/16)增至100%(16/16)。目前，國內(nèi)雖尚未普及針對SARS-CoV-2抗體的檢測，但隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，血清學(xué)檢測同樣也將成為確診病毒感染的重要方法[16]。

本研究回顧性總結(jié)了本院28例COVID-19確診病例的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征，以及病毒核酸檢測的取樣方法、采集次數(shù)，進(jìn)一步評價了咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測對診斷COVID-19的臨床價值，SARS-CoV-2核酸檢測陰性并不能排除SARS-CoV-2感染；同時分析了造成SARS-CoV-2核酸檢測假陰性的潛在原因，并列舉文獻(xiàn)總結(jié)提高確診率的可能方法。

綜上所述，鼻咽拭子、咽拭子作為發(fā)熱門診首選的SARS-CoV-2核酸采集方式，具有簡便、易行的優(yōu)勢，但其結(jié)果陰性并不能排除COVID-19。本研究的不足之處在于此次研究為單中心回顧性研究，且病例數(shù)較少，標(biāo)本采集方式及采集部位較為單一，無法進(jìn)一步明確SARS-CoV-2在人體內(nèi)的分布是否與病程相關(guān)，是否需根據(jù)患者病程長短選擇不同的標(biāo)本進(jìn)行檢測有待研究。期待今后更多的臨床數(shù)據(jù)驗證本研究結(jié)論。