COVID-19患者淋巴細(xì)胞數(shù)及Th/Tc值預(yù)測(cè)病情進(jìn)展研究

孫曉東，朱 波，柴森茂，陶艷麗，魯晶晶，徐紅霞，許倩倩，周 圍，葛京京，桑 明

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441000； 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科康復(fù)科，湖北 襄陽(yáng) 441000； 3. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 襄陽(yáng) 441000； 4. 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000)

2019年12月以來(lái)，湖北省武漢市陸續(xù)出現(xiàn)了多例不明原因病毒性肺炎患者，部分患者病情迅速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，并出現(xiàn)醫(yī)護(hù)及密切接觸者感染現(xiàn)象，后證實(shí)為新型冠狀病毒感染。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)命名此次新型冠狀病毒引起的疾病為COVID-19(coronavirus disease 2019)。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將此病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。SARS-CoV-2是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV[引發(fā)嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)][1]和MERS-CoV[引發(fā)中東呼吸綜合征(MERS)][2]。SARS-CoV-2感染機(jī)制、臨床表現(xiàn)與SARS相似[3]，對(duì)SARS死亡患者和動(dòng)物模型的研究表明，過(guò)度和異常的宿主免疫反應(yīng)是導(dǎo)致疾病快速惡化、致命的病因[4-6]。SARS死亡患者肺間質(zhì)和肺泡濾液中有大量炎性浸潤(rùn)細(xì)胞，與外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量增加以及Th和Tc細(xì)胞計(jì)數(shù)降低有關(guān)[7-8]。我國(guó)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》一直強(qiáng)調(diào)淋巴細(xì)胞(TLC)減少與重癥有關(guān)聯(lián)，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》增加重型、危重型臨床預(yù)警指標(biāo)，針對(duì)成人包括：外周血TLC進(jìn)行性下降，外周血炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)進(jìn)行性上升，乳酸進(jìn)行性升高，肺內(nèi)病變?cè)诙唐趦?nèi)迅速進(jìn)展[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者血漿中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子水平上升, 包括IL-2、7、10, 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF), 干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP-10), 單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1), 巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP1-α)和腫瘤壞死因子α(TNF-α), 尤其是在危重癥患者中升高更加明顯[10-11]，SARS-CoV-2感染患者在影像學(xué)上出現(xiàn)了特征性的肺磨玻璃影改變[8,12]，病理學(xué)特征為ARDS，與SARS-CoV和MERS-CoV感染相似，外周血中Th和Tc細(xì)胞數(shù)量明顯減少，但這些細(xì)胞處于過(guò)度激活狀態(tài)[13]。SARS-CoV-2感染者中也存在嚴(yán)重的肺部炎癥和細(xì)胞因子風(fēng)暴。

在COVID-19感染者重癥化過(guò)程中，炎癥風(fēng)暴的發(fā)生可能扮演了重要角色[14]。炎癥風(fēng)暴也是引起ARDS和多器官衰竭的重要原因[15]。目前，對(duì)SARS-CoV-2感染導(dǎo)致機(jī)體炎癥風(fēng)暴發(fā)生的關(guān)鍵炎性因子仍需進(jìn)一步研究，COVID-19炎癥風(fēng)暴的發(fā)生機(jī)制及預(yù)測(cè)評(píng)估方式尚不明確，TLC、CD4+輔助性T細(xì)胞與CD8+效應(yīng)T細(xì)胞比值(Th/Tc)能否作為COVID-19重癥化評(píng)估和預(yù)測(cè)指標(biāo)亟待闡明。本研究收集某院12例確診患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)資料，分析不同病情患者TLC、Th/Tc值，判斷以TLC、Th/Tc值評(píng)估COVID-19患者病情進(jìn)展的可行性，以進(jìn)一步了解SARS-CoV-2感染的病理、生理機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2020年1月28日—2月10日某院12 例COVID-19確診病例。患者均于收治當(dāng)日通過(guò)咽拭子采樣后送SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，并行胸部CT檢查，經(jīng)2次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性，5例病例在入院后病情進(jìn)展迅速，納入重型/危重型組；7例病例病情平穩(wěn)，納入輕型/普通型組。本研究已通過(guò)襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2020GCP005)，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 最初的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清生化檢測(cè)、肝和腎功能、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、電解質(zhì)、尿常規(guī)、血?dú)夥治?、CRP、血沉(ESR)、降鈣素原(PCT)、肌紅蛋白(MYO)、凝血，以及胸部CT。使用經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的Realtime逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法，檢測(cè)包括鼻咽拭子或痰在內(nèi)的呼吸道標(biāo)本，以排除流感病毒、呼吸道合胞病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等感染。

1.2.2 外周血TLC和T細(xì)胞及其亞群檢測(cè) 采用多色抗人單克隆抗體(mAbs)聯(lián)合試劑PE-CD3/PE·CY7-CD8/BB515-CD4和匹配的同型對(duì)照，在入院后2 d內(nèi)測(cè)定外周血免疫細(xì)胞亞群。將外周血進(jìn)行抗體染色，裂紅液裂解紅細(xì)胞，采用絕對(duì)計(jì)數(shù)管進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。所有試劑均購(gòu)自BD公司(BD, Franklin Lakes, USA)，所有標(biāo)本均采用BD FACS Aria II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并使用BD流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量用均數(shù)表示，Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行比較。輕型/普通型組與重型/危重型組病例以(頻數(shù))百分?jǐn)?shù)表示，用χ2檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行比較，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本臨床特征 12例COVID-19患者中輕型/普通型組7例，重型/危重型組5例，兩組患者年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、癥狀特征比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 12例COVID-19患者流感病毒、呼吸道合胞病毒、HIV、HBV、HCV檢測(cè)均為陰性。兩組患者外周血TLC計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，輕型/普通型組患者TLC計(jì)數(shù)在正常值范圍下限，重型/危重型組患者TLC計(jì)數(shù)小于正常范圍值。兩組患者CRP、ESR、PCT濃度均高于正常水平。見(jiàn)表2。

2.3 外周血TLC分群流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 流式圈門(mén)策略及典型示例如圖1所示。對(duì)兩組患者TLC、T、Th、Tc以及Th/Tc值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并與正常值范圍進(jìn)行比較， COVID-19患者TLC占比低于正常值范圍，重型/危重型組較輕型/普通型組更低(圖2A)；兩組患者T細(xì)胞(CD3+)占比均在正常范圍(圖2B)；兩組患者Tc細(xì)胞(CD3+CD8+)占比均在正常范圍(圖2C)，COVID-19患者Th細(xì)胞(CD3+CD4+)占比高于正常范圍，重型/危重型組比輕型/普通型組患者更高(圖2D)； COVID-19患者Th/Tc值高于正常值范圍，重型/危重型組比輕型/普通型組患者更高(圖2E)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)重型/危重型組TLC和Th占比與正常值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A、D)。

表1 兩組COVID-19患者基本信息

表2 兩組COVID-19患者入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)比較

A:輕型/普通型組;B:重型/危重型組。

圖2 COVID-19患者外周血流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

流式檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組患者T淋巴細(xì)胞占比均在正常范圍內(nèi)；但絕對(duì)值均降低，輕型/普通型組、重型/危重型組T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(913±275) μL VS (526±228) μL，P=0.028]； 輕型/普通型組、重型/危重型組Th細(xì)胞占比高于正常值范圍，但絕對(duì)計(jì)數(shù)值均低于正常范圍值，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(530±99) μL VS(351±41) μL，P=0.004]；輕型/普通型組、重型/危重型組Tc細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值均低于正常范圍值，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(255±84) μL VS (128±70) μL，P=0.020]。

3 討論

冠狀病毒屬病毒是一類(lèi)具有囊膜、基因組為線(xiàn)性單股正鏈RNA病毒，是自然界廣泛存在的一大類(lèi)病毒。SARS-CoV-2是β屬冠狀病毒，2019年12月31日被明確是冠狀病毒，2020年1月3日毒株被分離，1月7日?qǐng)?bào)告地方和國(guó)家疾病預(yù)防控制中心。在近20年間，冠狀病毒已引發(fā)3次大規(guī)模的流行病，包括SARS、MERS和COVID-19。COVID-19重癥患者多在發(fā)病一周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等[10,13]。病毒逃避宿主免疫反應(yīng)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變作用被認(rèn)為是疾病嚴(yán)重程度的關(guān)鍵，SARS-CoV-2感染者與SARS-CoV及MERS-CoV感染患者相似，也存在嚴(yán)重的肺部炎癥和細(xì)胞因子風(fēng)暴[8,13,16]。肺部免疫損傷的嚴(yán)重程度與肺廣泛浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)，同時(shí)伴有中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量的增加，還伴有外周血樣本中Th和Tc細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低[16-18]。研究影響COVID-19患者預(yù)后的因素，發(fā)現(xiàn)Tc細(xì)胞顯著減少，中性粒細(xì)胞、Tc細(xì)胞比值與COVID-19患者預(yù)后相關(guān)[19]。

T細(xì)胞在獲得性免疫應(yīng)答以及清除病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Th/Tc值可以間接反映機(jī)體免疫狀態(tài)。Th細(xì)胞的功能為產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，傳遞抗原信息，促進(jìn)T、B細(xì)胞分化增殖，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和誘導(dǎo)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。Tc細(xì)胞是免疫反應(yīng)中的直接殺傷細(xì)胞，而Th/Tc值升高，表明細(xì)胞免疫功能處于“過(guò)度激活”狀態(tài)[20-21]。因此，Th/Tc值作為預(yù)測(cè)COVID-19患者重癥化指標(biāo)具有可行性。同濟(jì)大學(xué)對(duì)21例SARS-CoV-2感染患者免疫學(xué)特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示危重癥患者TLC、T細(xì)胞與中重度患者相比顯著降低，同時(shí)，Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞的計(jì)數(shù)在重癥和中重癥患者中均顯著下降[22]。與本研究結(jié)果一致。中科院和中國(guó)科技大學(xué)合作的研究結(jié)果顯示，在SARS-CoV-2感染后，患者Th細(xì)胞迅速被激活，成為致病性輔助T細(xì)胞(Th1)，并產(chǎn)生GM-CSF等細(xì)胞因子，SARS-CoV-2免疫病理報(bào)告提示存在致病性GM-CSF+Th1細(xì)胞和炎性CD14+、D16+單核細(xì)胞過(guò)度激活的免疫應(yīng)答現(xiàn)象。異常的、過(guò)度的免疫細(xì)胞可能大量進(jìn)入肺循環(huán)，對(duì)肺功能失能和快速死亡起免疫損傷作用[23]，表明COVID-19重癥患者出現(xiàn)過(guò)度免疫反應(yīng)與TLC計(jì)數(shù)減低，Th和Tc細(xì)胞比例失調(diào)有關(guān)。

本研究對(duì)12例COVID-19患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)兩組患者血尿素和肌酐水平等生化指標(biāo)無(wú)差異，重型/危重型患者TLC計(jì)數(shù)比輕型/普通型患者明顯減低(P<0.05)，因此，TLC可作為COVID-19患者重癥化的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；流式檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組患者T、Tc細(xì)胞的占比均在正常值范圍，Th細(xì)胞的占比高于正常值范圍，但絕對(duì)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，重型/危重型患者TLC、T、Th、Tc細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)比輕型/普通型患者明顯減低(P<0.05)，由此可見(jiàn)，單純從T、Th、Tc占比很難判斷患者病情與免疫狀態(tài)，TLC、T、Th、Tc細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)在判斷COVID-19患者病情進(jìn)展方面更有意義?，F(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，促炎因子水平與COVID-19患者重癥化密切相關(guān)[10-11,23]。但是，多種促炎因子的檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞及其亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)，不是所有級(jí)別的醫(yī)院都能快速完成。血常規(guī)檢測(cè)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，短時(shí)間內(nèi)即可得到TLC計(jì)數(shù)，可為醫(yī)生快速、初步判斷病情提供重要信息。重型/危重型患者Th/Tc值比輕型/普通型患者更高，說(shuō)明重型/危重型患者中發(fā)生過(guò)度激活的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)TLC、Th/Tc值判斷COVID-19患者的免疫狀態(tài)，預(yù)測(cè)炎癥水平，有一定的可行性，可以將TLC計(jì)數(shù)值、Th/Tc值作為患者炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，結(jié)合促炎因子指標(biāo)，判斷患者是否發(fā)生炎癥風(fēng)暴。本研究的局限性為病例數(shù)較少，沒(méi)有檢測(cè)炎癥因子指標(biāo)與TLC、T細(xì)胞、Th、Tc的相關(guān)性。因此，在條件充足的情況下仍應(yīng)該采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行T細(xì)胞及其亞群和細(xì)胞因子檢測(cè)，以獲得COVID-19病情進(jìn)展階段的直接證據(jù)，更好地指導(dǎo)臨床治療。