超聲-乙醇法提取塞北紫堇總生物堿工藝優(yōu)化*

錢宇超,盧永昌*,姚 政,辛青霞,潘國慶

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院,青海西寧810007;2.青海民族大學(xué)青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點實驗室,青海西寧810007;3.青海民族大學(xué)青海省藥物分析重點實驗室,青海西寧810007)

塞北紫堇(corydalis impatiens)為罌粟科紫堇屬植物。分布于我國西藏、青海、四川、甘肅等地。青海藏醫(yī)稱塞北紫堇為“扎?！?作為“帕下嘎”的代用品,有活血散瘀、祛風(fēng)利氣、除濕止痛等功效。塞北紫堇的主要藥理成分為生物堿[1]。

常用的溶劑總生物堿提取法有微波輔助提取法、酶輔助提取法、超微粉碎法、機械化學(xué)輔助提取法、超聲-酸水提取法等。而超聲-乙醇提取法相比其他方法有著提取耗時短、提取率高、操作簡便等優(yōu)勢[2]。研究塞北紫堇的超聲-乙醇法總生物堿提取工藝,對該藥材的后續(xù)研究與工業(yè)化生產(chǎn)有著重要意義。

1 材料與儀器

1.1 藥材

塞北紫堇采自青海省西寧市鳳凰山,由青海民族大學(xué)潘國慶教授鑒定為罌粟科紫堇屬植物corydalis impatiens。樣品采集后放置于背光處陰干,粉碎后過40目篩,經(jīng)烘箱烘至恒重。裝進密封袋保存于冰箱。

1.2 實驗試劑

甲醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司,批號：20181225);95%乙醇(分析純,天津市紅巖化學(xué)試劑廠,批號：20181023);原阿片堿(純度＞98%,中國藥品生物制品檢定所,批號：110853-201804);溴甲酚綠(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號：20170514);氫氧化鈉(分析純,天津市百世化工有限公司);鄰苯二甲酸氫鉀(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.3 實驗儀器

UPH-IV-10T型超純水機(成都超純科技有限公司);R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司,300W,50HZ);FA2104電子天平(舜宇恒平儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 總生物堿溶液的制備

精密稱取10 g備用藥材放入錐形瓶中,加入200 mL的85%乙醇超聲提取,抽濾后由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,加氨水調(diào)節(jié)pH至10,用氯仿萃取后回收萃取液,揮干后用甲醇定容至20 mL。

2.2 顯色劑與緩沖溶液的配置

顯色劑：精密稱取溴甲酚綠0.1 g,加入0.05mol/L的氫氧化鈉溶液2.8 mL,充分溶解后,再定容至200 mL。緩沖溶液(pH為4)：精密稱取10.2 g鄰苯二甲酸氫鉀溶解于1 L的RO水中。

2.3 總生物堿最大吸收波長的確定

精密吸取1mL總生物堿溶液至分液漏斗,再加入氯仿5 mL、緩沖液4 mL、顯色劑2 mL。振蕩后靜置分層,分液取氯仿相。空白對照為氯仿,行最大吸光度掃描確定波長范圍為200～800 nm。

2.4 原阿片堿標準曲線的繪制

精密吸取0.177 mg/mL的原阿片堿甲醇溶液各 1、2、4、6、8mL于10mL容量瓶中,由甲醇定容至10 mL。以2.3中所示方法測定420 nm波長下的吸光度。以濃度為橫坐標(X)、吸光度為縱坐標(Y)繪制標準曲線。

2.5 提取工藝的單因素實驗

精密稱取1 g塞北紫堇,分別考察不同乙醇濃度、液料比、提取時間、提取功率時的總生物堿得率。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗

以單因素實驗為基礎(chǔ),采用B-B設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面實驗。實驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面考察因素與水平Table 1 Factors and levels coding of response surface analysis

2.7 總生物堿的得率測定

提取后的總生物堿溶液按照2.3中所示方法測定波長420

nm處吸光度。由以下公式計算總生物堿得率：

Y為生物堿得率,單位為mg/g;C為經(jīng)標準曲線算得的總生物堿濃度,單位為mg/mL;V為提取液總體積,單位為mL;M為藥材質(zhì)量,單位為g

2.8 響應(yīng)面法數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面法總實驗結(jié)果使用Design-Expert軟件進行分析,軟件版本號為V8.0.6。

3 實驗結(jié)果

3.1 最大吸收波長

用可見分光光度計掃描(200～800nm波長)。以波長為橫坐標,吸光度為縱坐標制圖,顯示最大吸收波長處于420 nm處,見圖1。

圖1 總生物堿提取液吸收波長圖Figure 1 Absorption spectra of total alkaloids extract

3.2 標準曲線

標準曲線回歸方程為y=0.4082x-0.0113,R2=0.9992,表明該方法在0.0177～0.1416 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,標準曲線見圖2。

圖2 標準曲線圖Figure 2 Standard curve

3.3 單因素實驗結(jié)果

3.3.1 乙醇濃度

其他條件相同,不同乙醇濃度對總生物堿得率的影響如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對總生物堿得率的影響圖Figure 3 Effect of ethanol concentration on extraction rate

3.3.2 液料比

其他條件相同,不同液料比下總生物堿得率如圖4所示。

圖4 液料比對總生物堿得率的影響圖Figure 4 Effect of liquid/solid ratio on extraction rate

3.3.3 提取功率

其他條件相同,不同提取功率下總生物堿得率如圖5所示。

圖5 提取功率對總生物堿得率的影響圖Figure 5 Effect of ultrasonic power on extraction rate

3.3.4 提取時間

其他條件相同,不同提取時間下總生物堿得率如圖6所示。

圖6 提取時間對總生物堿得率的影響圖Figure 6 Effect of ultrasonic time on extraction rate

3.4 響應(yīng)面法實驗結(jié)果

經(jīng)計算后,實驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 2.Results of response surface experiment

3.5 響應(yīng)面實驗結(jié)果

將實驗結(jié)果輸入Design-Expert.V8.0.6軟件,結(jié)果的方差分析情況如表3所示。

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果方差分析情況Table 3 The analysis of variance.Results of the regression model

由軟件得出的回歸模型方程：生物堿得率Y=2.49-0.12A+0.12B-0.29C-4.167E-003D+0.19AB+0.087 AC+0.12AD +0.075BC-0.095BD-0.052CD-0.62A2-0.29B2-0.17C2-0.60D2

Y為生物堿得率,單位為mg/g;A為乙醇濃度,單位為%;B為液料比,單位為mL/g;C為提取時間,單位為min;D為提取功率,單位為W

由表3可知,模型的P＜0.0001,模型差異極其顯著,表明方程有效。模型的失擬項P=0.4866＞0.05,失擬項不顯著,證明模型擬合良好,誤差小。模型R2=0.9807＞0.9,證明該模型與實驗數(shù)據(jù)具有高擬合度,該模型可用于分析最優(yōu)工藝條件。

一次項除D(提取功率)以外均達到顯著,二次項 A2、B2、C2、D2均達到極顯著。 交互項中 AB、AD對總生物堿的提取達到顯著,AC、BC、BD、CD不顯著。綜合各項數(shù)據(jù)可以得出各提取條件對總生物堿提取的影響以重要性排序依次為C(提取時間)＞B(液料比)＞A(乙醇濃度)＞D(提取功率)。提取條件的交互作用可以由三維響應(yīng)面來直觀反映,見圖7。

圖7 提取條件之間的交互作用對提取率的影響示意圖Figure 7 Influence of interaction among extraction condition on the extraction rate

由Design-Expert.V8.0.6軟件求Y值最大時的最優(yōu)提取條件,軟件分析得出該條件為乙醇濃度：83.52%,液料比：40.88 mL/g,提取時間：42.42 min,提取功率：181.01W,生物堿得率：2.62625 mg/g。 由于實際操作的限制,將條件修正為乙醇濃度：84%,液料比：41 mL/g,提取時間：42.5 min,提取功率：180W。平行進行3次提取,經(jīng)計算后生物堿得率分別為 2.717、2.691、2.711 mg/g(RSD=0.5%),與理論值的相對誤差為3.05%,證明該模型有效反映了各提取條件與生物堿得率的變化關(guān)系。

4 結(jié)論

本實驗使用酸性染料比色法測定總生物堿得率,在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計的響應(yīng)面法優(yōu)化了塞北紫堇總生物堿的乙醇超聲提取法,得到了最優(yōu)工藝。經(jīng)驗證,最優(yōu)工藝下的理論值與實際值相對誤差僅為3.05%,證明響應(yīng)面法考慮了多種因素的交互作用,實驗結(jié)果準確可靠,對工藝的優(yōu)化效果顯著。