江西柘林湖水華藍(lán)藻
——長(zhǎng)孢藻(Dolichospermum)的形態(tài)多樣性及其分子特征*

張毅鴿，王一郎，楊 平，戴國(guó)飛，耿若真，李守淳，李仁輝2

(1：江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330000)

(2：中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072)

(3：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

(4：江西省水利科學(xué)研究院，南昌 330029)

水體富營(yíng)養(yǎng)化的防治是保護(hù)飲用水源地的重要內(nèi)容，因?yàn)樗w富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的水生態(tài)問(wèn)題就是藍(lán)藻水華的形成和暴發(fā). 藍(lán)藻水華暴發(fā)最直接的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和危害就是會(huì)產(chǎn)生對(duì)其他生物有毒的藍(lán)藻毒素以及具有刺激性氣味的異味物質(zhì). 我國(guó)常見的藍(lán)藻水華類型主要有微囊藻(Microcystis)水華、長(zhǎng)孢藻(Dolichospermum)水華、束絲藻(Aphanizomenon)和擬柱孢藻(Cylindrospermopsis)水華等. 其中微囊藻水華的研究最為關(guān)注，因?yàn)槭澜缟铣^(guò)85%以上的藍(lán)藻水華都是微囊藻為優(yōu)勢(shì)種的水華，如我國(guó)的太湖、滇池[1-2]；國(guó)外的維多利亞湖和伊利湖[3-4]. 然而隨著藍(lán)藻水華研究的深入，許多水體報(bào)道了其他藍(lán)藻水華，或是其他藍(lán)藻水華和微囊藻水華的季節(jié)交替現(xiàn)象，如韓國(guó)的漢江飲用水源地就暴發(fā)了長(zhǎng)孢藻水華[5]. 長(zhǎng)孢藻被認(rèn)為是除微囊藻外的最易引發(fā)藍(lán)藻水華的類群，與其他水華藍(lán)藻相比，長(zhǎng)孢藻屬包含更多的種類，并且許多種類不僅被報(bào)道具有產(chǎn)微囊藻毒素、魚腥藻毒素、擬柱孢藻毒素能力[6]，而且能夠產(chǎn)生多種異味物質(zhì)即土腥素(geosmin)、2-甲基異茨醇(2-MIB)[7]，長(zhǎng)孢藻在水體的出現(xiàn)能夠?qū)λ镆约叭祟惤】稻哂袧撛诘耐{.

長(zhǎng)孢藻是絲狀具異形胞藍(lán)藻，廣泛生活在淡水水體. 長(zhǎng)孢藻屬是Wacklin等[8]2009年根據(jù)DNA序列和分子生物學(xué)系統(tǒng)證據(jù)，把具有氣囊的浮游性的魚腥藻，從魚腥藻屬(Anabaena)分離出來(lái)，形成一個(gè)獨(dú)立的新屬. 所以目前的魚腥藻屬的種類都屬于細(xì)胞無(wú)氣囊結(jié)構(gòu)的附著性絲狀藍(lán)藻. 長(zhǎng)孢藻屬作為念珠藻目束絲藻科下的一個(gè)分支，目前在分類學(xué)上被認(rèn)可的種類有55種之多[9]，但在基于16S rRNA基因分子序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)孢藻屬下的許多同種類的不同藻株常常無(wú)法很好地形成一簇，因此難以同形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果相符[10]，而16S rRNA和23S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)為在進(jìn)化上高度變異，為高變區(qū)[11]，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可以用于原核生物同屬下種的區(qū)分. 因此，對(duì)水體中形成水華的長(zhǎng)孢藻的鑒定中，有必要結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征和分子遺傳特性進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其是否具有產(chǎn)毒和產(chǎn)異味能力進(jìn)行甄別，對(duì)判斷水體是否具有長(zhǎng)孢藻水華的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其預(yù)警是具有重要意義的.

位于江西九江市的柘林湖通過(guò)修河與鄱陽(yáng)湖相連，其庫(kù)區(qū)總?cè)萘?9.2×108m3，水域面積308 km2，連接修河流域面積 9340 km2，是鄱陽(yáng)湖最大的入湖湖庫(kù)[12]. 柘林湖作為九江市的主要水源地，亦為其城鄉(xiāng)生活污水及工業(yè)廢水的去向，是集飲水源與廢水為一體的湖庫(kù)，其局部湖區(qū)水生態(tài)有逐步退化的跡象. 2015年，作為柘林湖 3個(gè)大型飲用水源地的東渡水源地被指出存在長(zhǎng)孢藻水華[13]，其水體散發(fā)出的明顯土腥異味，表明柘林湖湖區(qū)的飲用水存在著安全風(fēng)險(xiǎn). 因此有必要對(duì)在柘林湖湖中能夠引發(fā)水華暴發(fā)的長(zhǎng)孢藻種類進(jìn)行更為深入的研究，特別是從水體分離長(zhǎng)孢藻藻株為起點(diǎn)的形態(tài)特征和分子特征的研究，進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定. 因此本研究對(duì)柘林湖不同區(qū)域采集新鮮水樣進(jìn)行初步判斷鑒定，并從中分離純化培養(yǎng)獲得長(zhǎng)孢藻藻株，利用其形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育及16S-23S rRNA的ITS基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)，對(duì)所獲得的長(zhǎng)孢藻進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定. 通過(guò)與鄱陽(yáng)湖中分離的長(zhǎng)孢藻藻種對(duì)比，推斷鄱陽(yáng)湖長(zhǎng)孢藻的可能發(fā)生源，進(jìn)一步分析長(zhǎng)孢藻水華的擴(kuò)散路徑，從而消除異地藍(lán)藻水華而引起的大范圍的藍(lán)藻暴發(fā). 同時(shí)檢測(cè)其是否具有產(chǎn)毒產(chǎn)異味的潛力，為柘林湖的水質(zhì)管理與水體利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

于2019年4-12月，分別在柘林湖的西海燕碼頭(29°15′53″N，115°6′21″E)、宋溪灣(29°15′53″N，115°6′21″E)、東渡取水口(29°15′41″N，115°7′39″E)、巾口碼頭(29°18′37″N，115°15′35″E)、排污口(29°16′41″N，115°8′58″E)、柘林庫(kù)大壩(29°12′34″N，115°29′34″E)共設(shè)置6個(gè)采樣點(diǎn). 使用25#浮游生物網(wǎng)對(duì)水表至0.5 m深的表層水以20～30 cm/s的速度緩慢以“∞”形來(lái)回拖動(dòng)浮游生物網(wǎng)富集水表浮游植物.

1.2 藻株分離及培養(yǎng)

采用經(jīng)典的毛細(xì)管分離法：將巴氏吸管置于酒精燈上，加熱制為不同孔徑的毛細(xì)管(Psateur Micropipette)，把采集的混有長(zhǎng)孢藻的水樣滴在凹形玻璃片凹處，置于解剖鏡下用毛細(xì)管吸取單根藻絲于含有CT培養(yǎng)基的24孔板中. 在溫度25℃，光照強(qiáng)度為30 μmol protons/(m2·s)，光照周期為12 h∶12 h(L∶D)的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約30天，并于倒置顯微鏡下觀察24孔板，將獲得長(zhǎng)孢藻純?cè)逯甑呐囵B(yǎng)孔轉(zhuǎn)接至含有10 mL CT培養(yǎng)基的玻璃試管中進(jìn)行保種.

1.3 藻株的形態(tài)觀察

使用外接數(shù)碼相機(jī)(DS-Ri1)的Nikon Eclipse 80i型光學(xué)顯微鏡，觀察長(zhǎng)孢藻藻株形態(tài)，并通過(guò)附帶的分析軟件NIS-Elements D3.2對(duì)不同類型的細(xì)胞(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、異形胞、厚壁孢子)進(jìn)行測(cè)量.

1.4 藻株的DNA提取、PCR及克隆

對(duì)藻株生物量進(jìn)行低速離心富集，使用傳統(tǒng)的 CTAB 法提取藻株DNA. 選取16S rRNA、16S-23S rRNA間的ITS基因(引物如表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL，即：5～10 ng模板DNA，1 U Taq DNA聚合酶，2×PCR緩沖液(含1.5 mmol/L MgCl2，10 pmol引物，200 mmol/L dNTPs)，dd H2O補(bǔ)足體系. 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，接著35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃終延伸5 min. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的片段，通過(guò)BioFlux 膠回收試劑盒回收. 用pMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取具氨芐抗性的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序.

表1 本研究所用的引物序列

1.5 序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，然后在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的相關(guān)基因序列，用MAFFTv.7.321進(jìn)行多重序列比對(duì)[16]，運(yùn)用 Mega v7.0.14軟件選擇序列保守區(qū)，用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建. 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建選擇最大似然法(ML)，用 Mrmodeltest v.2.3 軟件對(duì)多重序列比對(duì)結(jié)果選擇核酸替代模型(GTR+I+G)[17]進(jìn)行貝葉斯(BI)和最大似然法(ML)分析，利用iqtree(http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)進(jìn)行ML進(jìn)化樹的構(gòu)建[18]，步展值(Bootstrap value)設(shè)置為1000，獲得的進(jìn)化樹，采用Figtree v1.4.4軟件展示. ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建：采用BioEdit v. 7.1.3軟件[19]找出ITS保守的D1-D1’、Box-B和V3螺旋，使用Mfold 3.1構(gòu)建二級(jí)結(jié)構(gòu)[20]. 本研究藻株的16S rRNA和ITS序列提交給Algae-Hub數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)為AH_C000003～AH_C000026.

1.6 藻株的毒素合成基因與產(chǎn)異味基因檢測(cè)

對(duì)柘林湖長(zhǎng)孢藻藻株使用表2引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測(cè)長(zhǎng)孢藻藻藻株是否具有微囊藻毒素基因(mcyE)、魚腥藻毒素-a基因(ATXs)、擬柱孢藻毒素基因(cyrJ)以及產(chǎn)異味的土腥素基因(geosmin).

表2 藍(lán)藻毒素合成基因和土腥素合成基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)孢藻形態(tài)特征

從柘林湖中共分離24株長(zhǎng)孢藻(表3)，形態(tài)學(xué)鑒定如下(圖1).

2.1.1 浮游長(zhǎng)孢藻(Dolichospermumplanctonicum) 藻絲呈直線，單生，自由漂浮狀態(tài)，部分藻絲略彎，具有較厚的膠鞘. 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有氣囊，呈圓或扁圓形，直徑為7.04～11.24 μm. 異形胞單個(gè)間生，呈圓形，直徑為8.72～11.24 μm. 厚壁孢子為橢圓形，多數(shù)藻絲單個(gè)間生，部分藻絲含多個(gè)，長(zhǎng)為14.93～24.97 μm，寬為8.54～13.71 μm.

2.1.2 近親長(zhǎng)孢藻(D.affine) 藻絲自由漂浮，呈直或略彎狀，聚群而居，相互之間形成束狀，具有膠鞘. 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有氣囊，藻絲中間，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈球形或者近球性，兩端漸細(xì)，且末端營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈圓柱狀，直徑為3.53～7.01 μm，異形胞近球形，略大于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，直徑為5.78 μm.

2.1.3 卷曲長(zhǎng)孢藻(D.circinale) 藻絲自由漂浮，螺旋盤繞，少數(shù)呈直線狀，大多數(shù)不具有膠鞘. 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有氣囊，呈球形或者扁球形，長(zhǎng)略小于寬，直徑為8.76～10.65 μm，藻絲螺旋直徑為37.4～119.3 μm.

2.1.4 螺旋長(zhǎng)孢藻(D.spiroides) 藻絲單生，呈自由漂浮狀態(tài)，藻絲呈有規(guī)律的螺旋彎曲，具有膠鞘，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有氣囊，球形或扁球形，直徑為6.29～8.81 μm，且寬略大于長(zhǎng). 部分藻絲具有多個(gè)異形胞，且異形胞近球形，為7.01～7.63 μm. 藻絲的螺間距為8.1～35.6 μm，螺旋直徑為27.9～45.2 μm.

表3 柘林湖長(zhǎng)孢藻藻株的形態(tài)特征

圖1 光學(xué)顯微鏡下長(zhǎng)孢藻的形態(tài)：(a～b)近親長(zhǎng)孢藻，(c)卷曲長(zhǎng)孢藻，(d)浮游長(zhǎng)孢藻，(e～f)螺旋長(zhǎng)孢藻

2.2 分子系統(tǒng)分析

24株長(zhǎng)孢藻共獲得24條長(zhǎng)孢藻的16S rRNA基因序列，多序列比對(duì)構(gòu)建長(zhǎng)度為1001 bp的矩陣. 通過(guò)觀察16S rRNA基因構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)兩株近親長(zhǎng)孢藻CHAB5815、CHAB5828與DolichospermumaffineNIES-1641的相似度均超過(guò)99%，并很好的聚在一支上. 螺旋長(zhǎng)孢藻CHAB5816、CHAB5822與未知種名長(zhǎng)孢藻CHAB5818的形態(tài)差異很大，卻聚在同一支上. 卷曲長(zhǎng)孢藻CHAB5805、CHAB5807聚在一支上，而浮游長(zhǎng)孢藻CHAB5801、CHAB5802、CHAB58010、CHAB5831雖屬同一種，但在ML系統(tǒng)發(fā)育樹是并系類群，與日本的浮游長(zhǎng)孢藻相距甚遠(yuǎn)，表明不同地域的各種長(zhǎng)孢藻相互混雜，不能將長(zhǎng)孢藻屬下的不同種類很好地區(qū)分.

2.3 長(zhǎng)孢藻ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)

本研究選取24株長(zhǎng)孢藻的ITS基因構(gòu)建二級(jí)結(jié)構(gòu)，來(lái)比較長(zhǎng)孢藻的種間差異. ITS序列中的D1-D1’、Box-B和V3螺旋用以區(qū)分同屬間不同種(表4).

在D1-D1’區(qū)域中(圖3)，浮游長(zhǎng)孢藻(CHAB5801、CHAB5802、CHAB5810)、螺旋長(zhǎng)孢藻(CHAB5808、CHAB5809、CHAB5816)、卷曲長(zhǎng)孢藻(CHAB5805、CHAB5807)和近親長(zhǎng)孢藻(CHAB5815、CHAB5828)的D1-D1’ 螺旋結(jié)構(gòu)都具有4個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且由70個(gè)堿基組成，盡管4種長(zhǎng)孢藻物種其D1-D1’螺旋結(jié)構(gòu)堿基對(duì)不同，但其D1-D1’螺旋結(jié)構(gòu)相同. 長(zhǎng)孢藻CHAB5804的D1-D1’螺旋結(jié)構(gòu)由68個(gè)堿基組成，緊接著基部莖的二，三雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(3 bp，3 bp)小于浮游長(zhǎng)孢藻的二，三雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(5 bp，9 bp). 長(zhǎng)孢藻CHAB5804與浮游長(zhǎng)孢藻的藻株形態(tài)雖同為直鏈型，但兩者的D1-D1’的螺旋結(jié)構(gòu)差異較大.

在Box-B區(qū)域中(圖4)，浮游長(zhǎng)孢藻(CHAB5801、CHAB5802、CHAB5810)和近親長(zhǎng)孢藻(CHAB5815、CHAB5828)的結(jié)構(gòu)相同，都由28個(gè)堿基組成，且具有2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但其Box-B螺旋結(jié)構(gòu)的堿基不同. 螺旋長(zhǎng)孢藻(CHAB5808、CHAB5809、CHAB5816)的Box-B螺旋結(jié)構(gòu)也是由28個(gè)堿基組成，且具有2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但其頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)(7 bp)大于浮游長(zhǎng)孢藻、近親長(zhǎng)孢藻的頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)(5 bp). 卷曲長(zhǎng)孢藻(CHAB5805、CHAB5807)的Box-B螺旋結(jié)構(gòu)由35個(gè)堿基組成，具有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分別為4 bp的頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)和7 bp的雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與其他種類的長(zhǎng)孢藻的環(huán)狀結(jié)構(gòu)差異較大. 總的來(lái)說(shuō)，浮游長(zhǎng)孢藻、近親長(zhǎng)孢藻的Box-B結(jié)構(gòu)相同，且與螺旋長(zhǎng)孢藻、卷曲長(zhǎng)孢藻的Box-B的螺旋結(jié)構(gòu)差異較大，而螺旋長(zhǎng)孢藻和卷曲長(zhǎng)孢藻的Box-B螺旋結(jié)構(gòu)差異明顯.

圖2 基于16S rRNA基因構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 長(zhǎng)孢藻ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)差異(浮游長(zhǎng)孢藻為對(duì)照)

圖4 長(zhǎng)孢藻的ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)(Box-B helix)(a: 浮游長(zhǎng)孢藻，b: 近親長(zhǎng)孢藻，c: 螺旋長(zhǎng)孢藻，d: 卷曲長(zhǎng)孢藻

在V3區(qū)(圖5)，浮游長(zhǎng)孢藻(CHAB5801、CHAB5802、CHAB5810)和近親長(zhǎng)孢藻(CHAB5815、CHAB5828)具有相同的結(jié)構(gòu)，其底部為6 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，隨后連接1個(gè)未成環(huán)的5 bp的半成環(huán)結(jié)構(gòu)，再緊接著為6 bp的雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且其環(huán)狀結(jié)構(gòu)兩側(cè)分別連接1個(gè)7 bp、4 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但浮游長(zhǎng)孢藻和近親長(zhǎng)孢藻組成V3螺旋結(jié)構(gòu)的堿基不同. 螺旋長(zhǎng)孢藻(CHAB5808、CHAB5809、CHAB5816)的V3螺旋結(jié)構(gòu)與浮游長(zhǎng)孢藻、近親長(zhǎng)孢藻的V3螺旋結(jié)構(gòu)略有差異，螺旋長(zhǎng)孢藻的V3螺旋結(jié)構(gòu)水平方向?yàn)? bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，小于浮游長(zhǎng)孢藻、近親長(zhǎng)孢藻水平方向的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(5 bp). 卷曲長(zhǎng)孢藻(CHAB5805、CHAB5807)與浮游長(zhǎng)孢藻、近親長(zhǎng)孢藻、螺旋長(zhǎng)孢藻的V3螺旋結(jié)構(gòu)差異較大，其底部為6 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，隨之為21 bp的未成環(huán)結(jié)構(gòu)，緊接著為一6 bp的雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，頂端為一4 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu). 長(zhǎng)孢藻CHAB5804的V3螺旋結(jié)構(gòu)與卷曲長(zhǎng)孢藻的V3螺旋結(jié)構(gòu)相似，但其頂端為一6 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且緊接著頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雙側(cè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的堿基為8 bp.

圖5 長(zhǎng)孢藻的ITS二級(jí)結(jié)構(gòu)(V3 helix)(a: 浮游長(zhǎng)孢藻，b: 螺旋長(zhǎng)孢藻，c: 近親長(zhǎng)孢藻，d: 卷曲長(zhǎng)孢藻，e: 長(zhǎng)孢藻 CHAB5804)

2.4 長(zhǎng)孢藻毒素合成基因與產(chǎn)異味基因檢測(cè)

對(duì)長(zhǎng)孢藻毒素合成基因及產(chǎn)異味基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，24株長(zhǎng)孢藻均未發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素、魚腥藻毒素及擬柱孢藻毒素的合成基因；長(zhǎng)孢藻是土腥味的主要生產(chǎn)者，Tsujimura等在2003年首次報(bào)道烏克蘭長(zhǎng)孢藻能夠產(chǎn)生geosmin[25]，且在維多利亞州[26]、韓國(guó)漢河[27]依次發(fā)現(xiàn)烏克蘭長(zhǎng)孢藻，卷曲長(zhǎng)孢藻均有產(chǎn)異味基因，而本研究的浮游長(zhǎng)孢藻CHAB5801、CHAB5810、CHAB5824、CHAB5831以及卷曲長(zhǎng)孢藻CHAB5825也均檢測(cè)出產(chǎn)異味基因(圖6).

圖6 長(zhǎng)孢藻geosmin基因擴(kuò)增電泳圖

3 討論

長(zhǎng)孢藻的藻絲形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)具有較高的多樣性，大多數(shù)的長(zhǎng)孢藻具有氣囊，可調(diào)節(jié)細(xì)胞浮力，營(yíng)浮游生活，所以也是水華藍(lán)藻的一大類群. 2009年Wacklin等[8]建立長(zhǎng)孢藻屬時(shí)，提出區(qū)分長(zhǎng)孢藻屬和魚腥藻屬的形態(tài)學(xué)依據(jù)是藻絲細(xì)胞是否有氣囊. 藻絲的特征、異形胞、厚壁孢子的形態(tài)及是否有膠被是鑒定長(zhǎng)孢藻屬下不同種類的主要形態(tài)學(xué)特征[28]，然而這些特征會(huì)因環(huán)境條件和培養(yǎng)時(shí)期的不同而變化[29]，甚至有些特征無(wú)法觀察到. 但是在缺少某些特征的情況下，我們綜合藻絲形態(tài)和形式，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和異形胞的形態(tài)和大小等特征以鑒定到種的水平. 本研究中的近親長(zhǎng)孢藻是唯一的藻絲成束的直型長(zhǎng)孢藻；而卷曲長(zhǎng)孢藻具有螺旋直徑巨大的特征，這些特征比較獨(dú)特地對(duì)應(yīng)到種的水平.

基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育分析，測(cè)序所得的所有長(zhǎng)孢藻藻株的序列都聚在長(zhǎng)孢藻屬的一支，與附著的魚腥藻類群完全分離，說(shuō)明長(zhǎng)孢藻與魚腥藻確實(shí)存在本質(zhì)的DNA分子序列的差別. 柘林湖的近親長(zhǎng)孢藻序列與日本的近親長(zhǎng)孢藻NIES-1641聚在一起，而浮游長(zhǎng)孢藻屬于并系類群，且沒有與日本的浮游長(zhǎng)孢藻NIES814聚在一起，可能由于環(huán)境因素等多方面原因?qū)е赂∮伍L(zhǎng)孢藻不同的特性[30]，從而引起序列差異性. 從形態(tài)上來(lái)看，長(zhǎng)孢藻CHAB5816、CHAB5822為螺旋長(zhǎng)孢藻，和未知種名的長(zhǎng)孢藻CHAB5818(直鏈型)在16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育聚在同一支上，說(shuō)明16S rRNA基因可以用于長(zhǎng)孢藻屬的水平上的鑒定，而其種類的區(qū)分并不能單根據(jù)16S rRNA基因序列來(lái)確定.

通過(guò)顯微觀察藻類細(xì)胞形態(tài)，能夠根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、異形胞及厚壁孢子鑒定長(zhǎng)孢藻的種類，然而對(duì)于沒有明顯特征的藻株，卻只能定義到屬，并且16S rRNA基因支持這個(gè)屬水平的鑒定. 以前大量的研究表明，藍(lán)藻許多屬內(nèi)的種類之間，可以利用16S-23S rRNA之間高度變異性的ITS基因間隔區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異來(lái)進(jìn)行鑒定[31]. 其中D1-D1’、Box-B和V3區(qū)域可以根據(jù)螺旋結(jié)構(gòu)的不同來(lái)分離許多藍(lán)藻屬內(nèi)的不同種類[32-34]. 但是在長(zhǎng)孢藻屬內(nèi)并沒有相關(guān)的研究. 本研究從柘林湖所獲得的24株長(zhǎng)孢藻藻株中，大多數(shù)浮游長(zhǎng)孢藻、螺旋長(zhǎng)孢藻、卷曲長(zhǎng)孢藻和近親長(zhǎng)孢藻的D1-D1’結(jié)構(gòu)相似，而個(gè)別長(zhǎng)孢藻Dolichospermumsp. CHAB5804的D1-D1’結(jié)構(gòu)與其他23株長(zhǎng)孢藻的D1-D1’差異較大，說(shuō)明長(zhǎng)孢藻屬內(nèi)的D1-D1’螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)兼有保守性和多樣性，對(duì)于長(zhǎng)孢藻屬內(nèi)種水平的區(qū)分還是存在一定的局限性. 在Box-B、V3區(qū)域中，浮游長(zhǎng)孢藻和近親長(zhǎng)孢藻螺旋結(jié)構(gòu)相同，但與螺旋長(zhǎng)孢藻、卷曲長(zhǎng)孢藻不同，說(shuō)明Box-B、V3螺旋結(jié)構(gòu)可以區(qū)分藻絲形態(tài)為直、彎的長(zhǎng)孢藻. 然而Hye等[35]發(fā)現(xiàn)新種Dolichospermumhangangense，其藻絲呈直線，并且與浮游長(zhǎng)孢藻在Box-B螺旋結(jié)構(gòu)不同，這與我們得出的結(jié)論不同，可能是因?yàn)殍狭趾h(huán)境因子差別小，導(dǎo)致柘林湖的長(zhǎng)孢藻分子結(jié)構(gòu)差異較小.

因此，16S rRNA基因不能很好地在長(zhǎng)孢藻的種水平進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)16S-23S rRNA也存在一定的局限性，而多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)作為微生物株系間多樣性的工具，能夠區(qū)分5500 億個(gè)多位點(diǎn)基因型，具有高分辨率，目前，MLST在藍(lán)藻中只有少數(shù)用于微囊藻種間差異的研究[36-37]，因此我們可以期待今后利用MLST區(qū)分長(zhǎng)孢藻的種水平.

長(zhǎng)孢藻是多種藍(lán)藻毒素及異味物質(zhì)的潛在生產(chǎn)者[38]，如微囊藻毒素不僅具有肝毒性，還是潛在的遺傳毒性致癌物[39-40]. 長(zhǎng)孢藻所產(chǎn)生的異味物質(zhì)多為土腥素，目前科學(xué)上關(guān)于土腥素對(duì)人體健康是否產(chǎn)生影響還不明確，但它仍然被認(rèn)為是導(dǎo)致飲用水不安全的主要異味物質(zhì)[41]. 柘林湖是九江市主要的水源地，確定湖水水體中是否含有藍(lán)藻毒素及異味物質(zhì)對(duì)柘林湖作為飲用水水源地的意義至關(guān)重要. 2015年柘林湖東渡水源地發(fā)生了長(zhǎng)孢藻水華[13]，其優(yōu)勢(shì)種類鑒定為水華長(zhǎng)孢藻，為主要的水華. 本研究對(duì)2019年4-9月間從柘林湖分離獲得的24株長(zhǎng)孢藻均檢測(cè)無(wú)藍(lán)藻毒素，并不代表著柘林湖不存在產(chǎn)藍(lán)藻毒素的長(zhǎng)孢藻，其原因可能為采樣點(diǎn)的區(qū)域局限性. 而在24株長(zhǎng)孢藻中就發(fā)現(xiàn)共5株(20.83%)包括4株浮游長(zhǎng)孢藻、1株卷曲長(zhǎng)孢藻含有土腥素，說(shuō)明柘林湖飲用水可能存在著被長(zhǎng)孢藻異味污染的威脅.

鄱陽(yáng)湖流域內(nèi)湖庫(kù)資源眾多，柘林湖作為鄱陽(yáng)湖最大的入湖湖庫(kù)，是鄱陽(yáng)湖流域內(nèi)最大的調(diào)節(jié)湖庫(kù). 以前的研究發(fā)現(xiàn)鄱陽(yáng)湖的長(zhǎng)孢藻種類主要有水華長(zhǎng)孢藻、卷曲長(zhǎng)孢藻、螺旋長(zhǎng)孢藻[42]、與本文中研究的部分長(zhǎng)孢藻的種類相同，存在著柘林湖中的長(zhǎng)孢藻對(duì)鄱陽(yáng)湖中的長(zhǎng)孢藻的種源貢獻(xiàn)的可能. 對(duì)于鄱陽(yáng)湖的長(zhǎng)孢藻的種源追溯和輸移路徑問(wèn)題，在今后的研究中將選擇變異性更高的基因片段或者ITS更長(zhǎng)的區(qū)域，基于高通量測(cè)序技術(shù)以獲得柘林湖以及鄱陽(yáng)湖長(zhǎng)孢藻的大量基因型，對(duì)于這些基因型的深入比較分析，結(jié)合將來(lái)對(duì)鄱陽(yáng)湖里分離的長(zhǎng)孢藻藻種的分子特征和比較研究，可以對(duì)上述問(wèn)題更加深入的認(rèn)識(shí)和詮釋. 本研究的方法和結(jié)果，不僅對(duì)柘林湖的水華藍(lán)藻的多樣性以及潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了科學(xué)的基礎(chǔ)資料，也在流域?qū)用嫔蠟檑蛾?yáng)湖的水生態(tài)系統(tǒng)研究和保護(hù)提供了一定的科學(xué)基礎(chǔ).