四君子湯對氣虛型急性胃腸功能損傷小鼠小腸Cajal間質(zhì)細胞及黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin表達的影響

黃立權(quán) 張志榮 江榮林 王坤根

〔摘要〕 目的 觀察四君子湯對氣虛型急性胃腸功能損傷小鼠小腸Cajal間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal， ICC）及黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin表達的影響。方法 將48只ICR小鼠隨機分為正常組（n=12）和實驗組（n=36），實驗組制備成標準氣虛型急性胃腸功能損傷小鼠模型，再隨機分為模型組、四君子湯組、自愈組，每組12只。正常組和模型組小鼠于造模成功后處死;四君子湯組小鼠給予四君子湯灌胃，自愈組小鼠等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃7 d，禁食不禁水12 h后處死。留取各組距離回盲部2 cm的小腸組織，行HE染色和免疫組化，觀察小鼠腸道ICC中c-kit及腸黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin表達的變化。結(jié)果 HE染色顯示四君子湯治療后小鼠腸黏膜損傷明顯改善;免疫組化顯示：與正常組比較，造模后實驗組各組c-kit及跨膜蛋白claudin-2、occludin表達明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，四君子湯組和自愈組c-kit及腸黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin表達明顯上升（P<0.01）;與自愈組比較，四君子湯組c-kit及腸黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin表達明顯上升（P<0.01）。結(jié)論 四君子湯可通過增加c-kit、claudin-2、occludin的表達改善腸道黏膜通透性和腸動力，以治療氣虛型急性胃腸功能損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 急性胃腸功能損傷;動物模型;跨膜蛋白;氣虛型;四君子湯

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.008

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Sijunzi Decoction on the expression of interstitial cells of Cajal （ICC） and intestinal mucosal epithelial transmembrane proteins claudin-2， occludin in acute gastrointestinal impairment mouse of Qi-deficiency. Methods A total of 48 ICR mice were randomly divided into a normal group （n=12） and an experimental group （n=36）. The experimental group was prepared into a standard acute gastrointestinal impairment mouse animal model of Qi-deficiency， and then randomly divided into a model group， a Sijunzi Decoction group， and a self-healing group （n=12 in each group）. The mice in the normal group and the model group were sacrificed after successfully modeling. Mice in the Sijunzi Decoction group were treated by gavage with Sijunzi Decoction， and mice in the self-healing group were given the equal saline， once a day， for continuous 7 days. They were killed after 12 days fasting food but not water. The small intestine tissue 2 cm away from ileocecum were retained. Then HE staining and immunohistochemistry were performed to observe the changes of c-kit in intestinal ICC and intestinal mucosal epithelial transmembrane proteins claudin-2 and occludin in mice. Results HE staining showed that the intestinal mucosal damage was obviously improved in mice after Sijunzi Decoction treatment. Immunohistochemistry showed that compared with the normal group， the expressions of c-kit and transmembrane proteins claudin-2 and occludin in the experimental group was significantly decreased after modeling （P<0.01）. Compared with the model group， the expressions of c-kit and intestinal mucosal epithelial transmembrane proteins claudin-2 and occludin in the Sijunzi Decoction group and self-healing group were significantly increased （P<0.01）. Compared with the self-healing group， the expression of c-kit and intestinal mucosal epithelial transmembrane proteins claudin-2 and occludin in the Sijunzi Decoction group were significantly increased （P<0.01）. Conclusion Sijunzi Decoction could increase the expression of c-kit， claudin-2 and occludin to improve the intestinal mucosa permeability and intestinal motility， and has a therapeutic effect on mice with acute gastrointestinal impairment of Qi-deficiency.

〔Keywords〕 acute gastrointestinal impairment; animal model; transmembrane protein; Qi-deficiency syndrome; Sijunzi Decoction

急性胃腸功能損傷（acute gastrointestinal function injury， AGI）是危重病患者的常見并發(fā)癥，是常繼發(fā)于創(chuàng)傷、燒傷、休克和其他全身性病變的一種胃腸道急性病理改變，以胃腸道黏膜損害以及運動和屏障功能障礙為主要特點。本病不是一組獨立的疾病，而是多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome， MODS）的一部分，可導致喂養(yǎng)不耐受、胃潴留、嘔吐、腹瀉、消化道出血、麻痹性腸梗阻及腹內(nèi)高壓甚至引發(fā)腹腔間隔室綜合征等。2012年，歐洲危重病學會對AGI重新作了定義和分級[1]，有文獻指出其在ICU的發(fā)病率達62%以上[2]，臨床上如果不及時處理，此類危重癥患者往往進展成多臟器功能衰竭，死亡率將大幅上升[3]。

AGI的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，西醫(yī)認為它是MODS的一個并發(fā)癥，但筆者根據(jù)大量的臨床病例發(fā)現(xiàn)很多危重癥患者在創(chuàng)傷、感染、出血等急性應激情況過去后和長期臥床機械通氣的患者均出現(xiàn)了胃腸功能損傷。從西醫(yī)學角度很難解釋這一現(xiàn)象，但中醫(yī)學能很好解釋這一理論：《脾胃論》有云“內(nèi)傷脾胃，乃傷其氣”，這類病人由于病情危重，無法自主進食而依靠全胃腸外營養(yǎng)，飲食不節(jié)，脾胃乃傷。脾胃氣虛，脾胃升降功能失司，進而影響小腸泌清別濁和大腸通降的功能，以致出現(xiàn)腹脹、腹瀉等癥狀，這與胃腸功能損傷的表現(xiàn)相一致。此類胃腸功能損傷患者在證型上符合中醫(yī)氣虛的臨床表現(xiàn)，疾病上符合“痞滿”“泄瀉”病范疇。

筆者運用中醫(yī)理論，建立了氣虛型AGI小鼠動物模型的制作方法，并申請了發(fā)明專利（國家發(fā)明專利號：ZL201410853675.0）。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)四君子湯能改善氣虛型AGI小鼠的腸黏膜通透性[4]，但是僅限于鏡下觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)。本研究通過建立氣虛型AGI小鼠模型，觀察四君子湯對小鼠小腸Cajal間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal， ICC）中c-kit及腸黏膜上皮跨膜蛋白claudin-2、occludin的影響，以期為深入研究四君子湯治療氣虛型AGI小鼠提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

健康成年SPF級雌性美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research， ICR）小鼠48只，體質(zhì)量18～22 g，購買于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0006，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（浙）2018-0012。飼養(yǎng)期間小鼠自由進食水，保證充足的飼料和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗，根據(jù)數(shù)字隨機表隨機選取小鼠，分組實驗。

1.2 ?藥物

四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，以上飲片均購自浙江省中醫(yī)院。按照此方傳統(tǒng)比例稱取中藥飲片，先用清水浸泡30 min，武火轉(zhuǎn)文火煎煮2次，每次45 min，合并兩次濾液，最終濃縮至每mL含生藥材500 mg。

1.3 ?主要試劑與儀器

兔抗鼠c-kit抗體、兔抗鼠claudin-2 抗體、兔抗鼠occludin抗體、羊抗兔二抗工作液（美國Santa Cruz CST 公司）;DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物制劑研究所）;Olympus光學顯微鏡（日本Olympus公司）;Nikon攝影生物光學顯微鏡（日本株式會社尼康）;Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.4 ?造模與分組

48只ICR小鼠隨機分為正常組（n=12）和實驗組（n=36），實驗組制備成標準氣虛型AGI小鼠模型[4]，再隨機組分為模型組（n=12）、四君子湯組（n=12）、自愈組（n=12）。造模成功后，將正常組和模型組小鼠處死，留取小腸組織。自愈組給予生理鹽水灌胃。四君子湯組給予四君子湯濃縮液灌胃，按照體表系數(shù)換算法，與人臨床劑量等效的小鼠劑量為5 g/（kg·d）。每日灌胃1次，兩組小鼠連續(xù)灌胃7 d，禁食不禁水12 h后頸椎脫臼處死，剖腹取小腸組織。

1.5 ?HE染色

頸椎脫臼處死各組小鼠后，剖腹取小腸（距回盲部2 cm）組織標本0.3 cm，10%甲醛固定，以不同濃度的酒精脫水，二甲苯透明，將已透明的組織置于已溶化的石蠟中，浸蠟，包埋，切成4 μm厚薄片，行HE常規(guī)染色。利用光學顯微鏡觀察小腸黏膜的腸絨毛、腸腺、腸上皮細胞的變化。

1.6 ?免疫組化染色

免疫組化檢測采用兩步法，小腸組織標本石蠟包埋，制成4 μm切片常規(guī)脫蠟及梯度脫水后，經(jīng)3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，高壓修復抗原后，滴加兔抗鼠c-kit、claudin-2、occludin抗體（稀釋濃度分別為1∶50、1∶100、1∶100）置于濕盒，4 ℃冰箱過夜。次日復溫后滴加羊抗兔二抗工作液，于37 ℃溫箱孵育30 min。經(jīng)DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明封片。所有切片用濱松NanoZoomer 2.0 RS掃描成像，每個切片圖像400倍放大后截取3個視野，采用IPP 6.0進行圖像分析，分析結(jié)果為總光密度，取平均值為蛋白表達強度。

1.7 ?統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)或近似正態(tài)分布計量資料的描述采用“x±s”表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩組間比較采用LSD法。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ?HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列整齊，胞漿豐富，胞質(zhì)紅染，小腸隱窩可見，黏膜下層和固有層未見水腫，未見炎癥細胞浸潤;模型組小腸黏膜局部脫落，腸腔內(nèi)可見脫落黏膜碎片，黏膜上皮細胞水腫明顯，局部隱窩消失，黏膜下層局部輕度水腫，可見少量炎癥細胞浸潤;自愈組黏膜結(jié)構(gòu)尚完整，可見少量脫落，局部黏膜上皮細胞水腫，黏膜下層及固有層輕度水腫，未見明顯炎癥細胞浸潤;四君子湯組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列整齊，胞漿豐富，胞質(zhì)紅染，小腸隱窩可見，黏膜下層和固有層未見明顯水腫，未見炎癥細胞浸潤，較模型組改善明顯，相比自愈組黏膜結(jié)構(gòu)較完整、黏膜下層水腫改善明顯。見圖1。

2.2 ?各組小鼠小腸組織c-kit、claudin-2、occludin免疫組化結(jié)果

實驗組各組c-kit、claudin-2、occludin表達較正常組顯著下降（P<0.01）。與模型組比較，四君子湯組和自愈組c-kit、claudin-2、occludin表達顯著上升（P<0.01）;與自愈組比較，四君子湯組c-kit、claudin-2、occludin表達顯著上升（P<0.01）。見表1和圖2。

3 討論

中醫(yī)中藥對于脾胃病的治療一直具有其獨特和公認的療效[5-6]。急性胃腸功能衰竭臨床辨證可分為熱毒型、血瘀型、氣虛型、濕熱型等幾種常見類型[7]，其中以氣虛型胃腸功能衰竭最為常見。因此，本研究取芒硝苦寒瀉下的特性，使小鼠久瀉而致氣虛，而芒硝本身對腸黏膜無損害作用[8]，從而說明氣虛是導致胃腸功能衰竭的一大原因。本實驗模型選用四君子湯進行治療，符合《太平惠民和劑局方》卷3中“榮衛(wèi)氣虛，臟腑怯弱。心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，嘔噦吐逆，大宜服之”的方義。方中人參甘溫，益氣補中為君;白術(shù)苦溫，健脾燥濕，合人參以益氣健脾為臣;茯苓甘淡，滲濕健脾為佐;炙甘草甘平，和中為使，可用于調(diào)和藥材，和中益氣[9]。四味皆為平和之品，溫而不燥，補而不峻，故名四君子湯。

AGI是危重病患者的常見并發(fā)癥，以胃腸道黏膜損害以及運動和屏障功能障礙為主要特點。ICC作為胃腸起搏細胞，主要參與胃腸基本電節(jié)律調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導，在胃腸運動機制中有重要作用，c-kit是ICC的特異性受體，可通過標記c-kit抗體來識別ICC[10-12]。腸黏膜屏障是一個復雜的半透屏障，主要由機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障共同構(gòu)成，機械屏障由腸道上皮細胞和他們之間的緊密連接構(gòu)成，是維持腸黏膜屏障功能的主要因素，閉合蛋白claudins對維持上皮細胞極性及調(diào)節(jié)胃腸功能的通透性發(fā)揮著重要作用[13]。因此，本試驗對小鼠小腸組織中c-kit及claudin-2、occludin的表達進行測定，以研究四君子湯對氣虛型AGI小鼠的治療作用。

HE染色結(jié)果顯示：四君子湯對于急性胃腸損傷小鼠的胃腸道動力和腸黏膜通透性增有明顯改善作用。免疫組化結(jié)果顯示：與正常組比較，實驗組各組c-kit、claudin-2、occludin表達明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，四君子湯組與自愈組c-kit、claudin-2、occludin表達顯著上升（P<0.01）;與自愈組比較，四君子湯組c-kit、claudin-2、occludin表達顯著上升（P<0.01）。結(jié)果表明，四君子湯可以促進c-kit及claudin-2、occludin的表達，增加ICC數(shù)量，維持腸黏膜的完整性。綜上所述，四君子湯能明顯改善氣虛型AGI小鼠的胃腸道動力和腸道黏膜通透性，為中醫(yī)藥治療氣虛型AGI提供了一定的實驗依據(jù)。但實驗目前尚處于初期階段，團隊后期將對其具體機制作進一步研究。

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