芍藥苷通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷

余婧萍 宋禎彥 李富周 賀春香 成紹武

〔摘要〕 目的 研究芍藥苷對(duì)氧化損傷細(xì)胞模型的抗氧化作用和細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。方法 以H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞系構(gòu)建氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組，模型組，芍藥苷低、中、高劑量組。采用MTT法檢測(cè)芍藥苷干預(yù)后細(xì)胞存活率;2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;Ad-mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒檢測(cè)細(xì)胞自噬水平;Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3及SQSTM1/p62的表達(dá)水平。結(jié)果 250 μmol/L H2O2干預(yù)24 h后SH-SY5Y細(xì)胞存活率約55%為模型復(fù)制條件。芍藥苷低、中、高劑量干預(yù)后，與模型組比較，細(xì)胞存活率呈劑量依賴(lài)性上升（P<0.05）。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;自噬溶酶體形成受阻;LC3Ⅱ及SQSTM1/p62在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。芍藥苷的干預(yù)可促進(jìn)自噬小體與溶酶體結(jié)合;與模型組比較，芍藥苷中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著下調(diào)（P<0.05）;細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ及SQSTM1/p62的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 芍藥苷可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬改善H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 芍藥苷;SH-SY5Y細(xì)胞;細(xì)胞自噬;LC3;SQSTM1/p62;氧化應(yīng)激;過(guò)氧化氫

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the antioxidant effect of Paeoniflorin on oxidative damage cell model and the regulation of autophagy. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was used to determine the cell activity and to construct the H2O2-induced cell damage model with the optimal time and dose. A control group， model group and low-dose， medium-dose and high-dose paeoniflorin groups were set up. MTT method was used to detect cell viability after PF intervention. 2′，7′-Dichlorofluorescin diacetate （DCFH-DA） was used to detect ROS. Ad mCherry-GFP-LC3B fusion protein was used to detect cell autophagy， and western blot was adopted to detect the expression level of LC3 and SQSTM1/p62 after the intervention. Results After 24 h of intervention with 250 μmol/L H2O2， SH-SY5Y cell viability was about 55%， which was the copy modeling condition. After low， medium and high-dose paeoniflorin intervention on H2O2 damaged cell model， compared with the model group， the cell viability showed a dose-dependent increase （P<0.05）. Compared with the control group， the intracellular ROS level of the model group increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）; autophagolysosome formation was blocked; the expression of LC3Ⅱ and SQSTM1/p62 increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The intervention of paeoniflorin can promote the combination of autophagosomes and lysosomes; compared with the model group， the level of ROS in the cells of the medium and high dose groups was significantly reduced （P<0.05）; the expression of LC3Ⅱ and SQSTM1/p62 was reduced， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Paeoniflorin can improve H2O2-induced oxidative damage of SH-SY5Y cells by promoting autophagy.

〔Keywords〕 paeoniflorin; SH-SY5Y; autophagy; LC3; SQSTM1/p62; oxidative stress; hydrogen peroxide

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease， AD）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其起病隱匿，與年齡高度相關(guān)。臨床上以進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙為主要特征，常表現(xiàn)為失語(yǔ)、失用、失認(rèn)等，嚴(yán)重時(shí)生活不能自理。據(jù)國(guó)際阿爾茲海默癥研究協(xié)會(huì)（Alzheimers Disease International，ADI）估計(jì)，世界上每3秒就會(huì)多一位癡呆患者，到2030年，全球癡呆患者總數(shù)將達(dá)到7 500萬(wàn)，到2050年，將達(dá)到1.3億[1]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大約100種類(lèi)型的癡呆，其中AD是目前老年人群中最常見(jiàn)的癡呆癥形式。AD對(duì)老年人的健康危害極大，已成為世界上第五大死亡原因[2]。隨著人類(lèi)社會(huì)人口老齡化趨勢(shì)日漸嚴(yán)峻，AD給社會(huì)和家庭帶來(lái)的影響已經(jīng)引起人類(lèi)社會(huì)的高度關(guān)注。

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的異常切割導(dǎo)致形成的不溶性β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）在細(xì)胞外沉積而形成的老年斑塊以及過(guò)度磷酸化的tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofbrillary tangles，NFTs）是AD的主要病理特征。這些毒性物質(zhì)在腦內(nèi)積聚引起海馬內(nèi)嗅皮層和CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞逐漸丟失導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[3]。研究表明，在AD早期，Aβ沉積和NFTs的形成之前，大腦海馬區(qū)存在活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多等氧化損傷特征[4]，且能促進(jìn)tau蛋白磷酸化和NFTs的形成[5]。氧化應(yīng)激是由于自由基和活性氧大量表達(dá)，氧化程度超出細(xì)胞清除能力而導(dǎo)致氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡引起的。ROS形成是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用，參與細(xì)胞的代謝與穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié);而過(guò)量的ROS累積會(huì)引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡[6]。H2O2是一種非常重要的活性氧，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白、核酸以及脂類(lèi)代謝產(chǎn)物不同形式的氧化改變，然后觸發(fā)細(xì)胞死亡[7]。此外，適量ROS可以激活細(xì)胞自噬，但大量ROS在細(xì)胞內(nèi)累積會(huì)阻礙細(xì)胞自噬的發(fā)生。AD和自噬之間存在聯(lián)系，自噬功能障礙可能會(huì)促進(jìn)AD的發(fā)病。研究表明，自噬體的無(wú)效降解在AD的病理過(guò)程中占有重要作用。通常，自噬泡（autophagic vacuoles，AVs）在正常大腦中很少見(jiàn)，但在AD患者的大腦中卻增加;此外，細(xì)胞自噬參與線(xiàn)粒體降解過(guò)程以維持細(xì)胞能量代謝平衡，研究表明AD腦內(nèi)存在能量代謝異常可能與自噬-溶酶體途徑異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損線(xiàn)粒體的降解不足有關(guān)[8]。AD早期存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)可損傷線(xiàn)粒體功能，線(xiàn)粒體功能障礙可能會(huì)進(jìn)而影響自噬-溶酶體途徑[9]。然而，AD中氧化應(yīng)激、自噬功能障礙和神經(jīng)元死亡之間的關(guān)系仍不清楚。因此，探索改善AD中氧化損傷及自噬功能障礙的有效藥物對(duì)于攻克AD這一世界難題具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》中有關(guān)于白芍的最早記載，為毛茛科植物芍藥的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)之功效。芍藥苷（paeoniflorin）是芍藥或牡丹根皮中提取的水溶性單萜苷，是中藥白芍的主要有效成分之一。研究表明，芍藥苷可改善AD[10]、帕金森氏病[11]、糖尿病性腎病[12]等疾病引起的損傷。芍藥苷對(duì)這些疾病的改善作用，可能是與其具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)自噬、改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用相關(guān)[13-15]。以往研究結(jié)果表明，芍藥苷可通過(guò)激活LKB1/AMPK信號(hào)通路改善大鼠缺血再灌注（I/R）損傷后的自噬障礙，從而有效緩解腸道I/R損傷[16]。芍藥苷還可改善氧化型低密度脂蛋白抑制的HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞活力，并通過(guò)增強(qiáng)自噬改善細(xì)胞受損，從而對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的損傷起到保護(hù)作用[17]。此外，芍藥苷還能通過(guò)自噬相關(guān)的鈣蛋白酶/Akt/GSK-3β相關(guān)途徑降低tau蛋白的過(guò)度磷酸化水平，從而減輕岡田酸對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損害。雖然目前關(guān)于芍藥苷改善自噬方面的研究已有一定成果，但尚未報(bào)道芍藥苷是否可以減輕氧化損傷或氧化應(yīng)激對(duì)AD早期神經(jīng)細(xì)胞的影響，需要進(jìn)一步研究其潛在分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型并給予不同濃度芍藥苷干預(yù)，觀(guān)察芍藥苷的抗氧化損傷作用及對(duì)細(xì)胞自噬的影響，探討芍藥苷調(diào)控自噬與改善氧化損傷之間的聯(lián)系。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞

SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入DMEM/F12（1∶1）完全培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）中培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA消化液（中國(guó)索萊寶公司）消化細(xì)胞，重懸，計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將細(xì)胞按不同密度接種至孔板中，或?qū)⒓?xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2 ?主要藥物和試劑

芍藥苷（IP0030）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，M8180）購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司;二甲基亞砜（DMSO，D806645）購(gòu)自中國(guó)麥克林公司;過(guò)氧化氫溶液（H2O2，323381）、2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，D6883）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒（Ad-mCherry-GFP-LC3B，C3011）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X，P0015L）購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司;RIPA裂解液（01408/504074）、蛋白酶抑制劑混合物（CW2200）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3227CH）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;Torin1（S2827）購(gòu)自Selleck Chemicals公司;小鼠單克隆SQSTM1/p62抗體（ab56416）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔多克隆LC3抗體（bs-8878R）和兔多克隆β-actin抗體（bs-0061R）購(gòu)自北京博奧森生物有限公司;山羊抗兔二抗（AP132P）和山羊抗小鼠二抗（AP124）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 ?主要儀器

加熱型五段程控金屬?。ū本┨旄萍加邢薰荆?化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）;小型臺(tái)式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）;倒置熒光顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）;多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）;共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 ?建立H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型

模型建立步驟參照本課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)[18]。

2.2 ?實(shí)驗(yàn)分組

待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，接種細(xì)胞：12孔板約1×105個(gè)/孔、6孔板約4×105個(gè)/孔。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求給予不同處理，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組（250 μmol/L H2O2）和芍藥苷低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）劑量組。

2.3 ?細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

12孔板中經(jīng)處理后的細(xì)胞，吸棄舊培養(yǎng)基加入工作濃度為1 μmol/L的DCFH-DA的新鮮培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS洗3次，使用倒置熒光顯微鏡成像，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，所采集的圖片使用Image J軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。平均熒光強(qiáng)度=區(qū)域熒光強(qiáng)度總和÷區(qū)域面積。

2.4 ?細(xì)胞自噬水平檢測(cè)

使用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞前先通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定感染細(xì)胞所需的病毒量，以不顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)、熒光較強(qiáng)且便于觀(guān)察的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI）值和感染后時(shí)間為最佳條件。本實(shí)驗(yàn)的感染條件如下：感染前一天于12孔板中以1×105個(gè)/孔接種SH-SY5Y細(xì)胞，每孔加入800 μL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使第二天感染細(xì)胞時(shí)細(xì)胞密度為50%左右;吸棄舊培養(yǎng)基，加入400 μL新鮮培養(yǎng)基，按MOI值為10計(jì)算每孔所需病毒量，加入病毒液。感染24 h之后，棄病毒液，每孔加入800 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入對(duì)應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗3次，用抗熒光淬滅劑封片后，使用共聚焦顯微鏡60倍物鏡下掃描成像。通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)綠色斑點(diǎn)（自噬體）與紅色斑點(diǎn)（自噬溶酶體）的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬情況。

2.5 ?Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白

6孔板中經(jīng)處理后的細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基，PBS輕洗細(xì)胞后，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，刮下細(xì)胞，將液體和細(xì)胞收集至1.5 mL EP管中;使用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后，于冰上靜置30 min，15 000×g、4 ℃離心10 min，吸取上清液至新的EP管中。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，調(diào)整蛋白濃度至2 μg/μL，100 ℃水浴20 min將蛋白變性，上樣量為20 μg。使用10%丙烯酰胺膠100 V電泳90 min，200 mA濕轉(zhuǎn)90 min將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶（TBST 配制）室溫封閉1 h后;一抗SQSTM1/p62、LC3（1∶1 000），β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜;TBST 洗膜后;按1∶1 000稀釋SQSTM1/p62、LC3，按1∶5 000稀釋?duì)?actin，4 ℃搖床孵育過(guò)夜;TBST洗膜后;按1∶10 000比例稀釋二抗，目的蛋白SQSTM1/p62使用山羊抗小鼠二抗;LC3及β-actin使用山羊抗兔二抗;于37 ℃搖床孵育1 h;TBST洗膜;按1∶1配制顯影液，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀成像;使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以SQSTM1/p62或LC3Ⅱ與β-actin的灰度值的比值來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)方法

采用Prism Graphpad 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料以“x±s”表示，先檢測(cè)正態(tài)性和方差齊性，方差齊時(shí)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），使用Student-Newman-Keuls進(jìn)行組間兩兩比較;方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，使用Wilcoxon兩樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。差異性用P值表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?芍藥苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS熒光成像結(jié)果顯示（圖1A），對(duì)照組綠色平均熒光強(qiáng)度低，提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低;經(jīng)H2O2處理后，模型組綠色平均熒光強(qiáng)度升高，與對(duì)照組相比（圖1B、F），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。與模型組相比，芍藥苷干預(yù)后，綠色平均熒光強(qiáng)度較模型組減弱（圖1C-F），提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平較模型組降低;芍藥苷中劑量、高劑量組綠色平均熒光強(qiáng)度降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1F）（P<0.05），提示芍藥苷中劑量、高劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，線(xiàn)粒體功能趨于穩(wěn)定。

3.2 ?芍藥苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平的影響

Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染后能在靶細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光蛋白（mCherry）、綠色熒光蛋白（GFP）和LC3B的融合蛋白。共聚焦顯微鏡成像結(jié)果顯示（圖2），與對(duì)照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)自噬小體呈綠色熒光，提示自噬體與溶酶體的結(jié)合過(guò)程受阻。而芍藥苷干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)自噬小體呈紅色熒光，提示芍藥苷可促進(jìn)自噬小體與溶酶體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)程，且芍藥苷促進(jìn)細(xì)胞自噬呈一定的濃度依賴(lài)性。

3.3 ?芍藥苷對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響

使用mTORC1/2的抑制劑Torin1作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞LC3及SQSTM1/p62的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，LC3Ⅱ、SQSTM1/p62水平升高，提示自噬-溶酶體通路受損;而芍藥苷可在一定程度上逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，改善細(xì)胞自噬受損。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癡呆的主要病理機(jī)制為腎虛髓虧，腦髓失養(yǎng)，神機(jī)失用，以五臟不足為本，血瘀痰阻為標(biāo)。癡呆的病位在腦，并與心、肝、脾、腎的功能失調(diào)密切相關(guān)。肝易動(dòng)難靜，善干他臟，故古有“肝為萬(wàn)病之賊”之說(shuō)。肝主疏泄調(diào)暢全身氣機(jī);肝失疏泄可影響脾胃氣機(jī)，以致生化乏源，心血腎精無(wú)處化生，則腦髓失養(yǎng)。此外，肝藏血，腎藏精，肝腎精血同源，肝主疏泄以助精血津液在全身的運(yùn)行與輸布。若肝血不足，腎精則無(wú)以化生;腎精虧損，則無(wú)以充養(yǎng)腦髓，腦絡(luò)失養(yǎng)?？傊握９δ苁д{(diào)會(huì)進(jìn)而累及他臟，最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生。通過(guò)對(duì)老年癡呆用藥相關(guān)數(shù)據(jù)的分析顯示，歸肝經(jīng)藥物數(shù)量位于首位，而癡呆中醫(yī)證型的統(tǒng)計(jì)表明，“肝腎陰虛證”為癡呆最常見(jiàn)的證型[19]，因此，“治肝”在癡呆的治療中顯得尤為重要。白芍性微寒，入肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血柔肝止痛等作用。文獻(xiàn)分析結(jié)果顯示，白芍是治療癡呆方劑中的常用藥物，其主要成分為芍藥苷[19-20]。雖然芍藥苷目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)研究及臨床治療，但其對(duì)AD病理過(guò)程的影響機(jī)制尚待闡明。

前期研究結(jié)果顯示，Aβ的聚集會(huì)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，芍藥苷可抑制一氧化氮合酶（NOS）的活性，降低ROS水平[21];同時(shí)也能抑制Aβ的生成，減少Aβ的聚集[22]。本課題組前期研究結(jié)果表明，給予不同濃度芍藥苷干預(yù)24 h后，5 μmol/L的芍藥苷可以提高H2O2損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率，20 μmol/L的芍藥苷干預(yù)達(dá)到峰值[23]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷可降低H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，從而可能改善了線(xiàn)粒體的受損狀態(tài)，這可能對(duì)于改善先于Aβ沉積及NFTs出現(xiàn)的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的影響具有重要意義。此外，細(xì)胞代謝異常能影響β淀粉樣蛋白的生成、積累和Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，可以加劇線(xiàn)粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)[24]。芍藥苷可以減少岡田酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中高度磷酸化Tau蛋白的水平，降低自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)[15]。但芍藥苷是否可以通過(guò)調(diào)控自噬改善氧化損傷對(duì)細(xì)胞的影響尚未報(bào)道。本研究使用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染后，共聚焦成像結(jié)果顯示，芍藥苷可促進(jìn)H2O2損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞自噬溶酶體的形成。

AD早期存在線(xiàn)粒體功能紊亂，線(xiàn)粒體功能紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝、鈣離子平衡失調(diào)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。芍藥苷可通過(guò)降低ROS及鈣離子的生成，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[25-26]。此外，細(xì)胞自噬的正常進(jìn)行對(duì)于清除衰老、受損的細(xì)胞或細(xì)胞器、維持細(xì)胞正常功能具有重要意義。盡管ROS是自噬的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑，但過(guò)量產(chǎn)生ROS會(huì)抑制自噬。LC3是最早發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)記物，在細(xì)胞內(nèi)以?xún)煞N形式存在，LC3Ⅰ存在于細(xì)胞質(zhì)，LC3Ⅱ定位于自噬體膜，因此，LC3Ⅱ常被作為自噬活性的檢測(cè)指標(biāo)。在自噬體膜形成過(guò)程中，LC3前體被Atg4B剪切成LC3Ⅰ，隨后LC3Ⅰ與磷脂乙酰胺（PE）共價(jià)結(jié)合形成LC3-PE復(fù)合物，即膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ[27]。因此，隨著自噬小體的形成，LC3Ⅱ在自噬體膜的表達(dá)會(huì)逐漸增加。隨后，自噬體與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體并降解，自噬體膜上的LC3Ⅱ會(huì)被Atg4B脂化，重新變成LC3Ⅰ[28]。SQSTM1/p62作為自噬受體蛋白在自噬過(guò)程中會(huì)先與泛素化蛋白結(jié)合，再與定位于自噬小體膜上的LC3Ⅱ連接，促進(jìn)自噬小體的降解，因此在自噬過(guò)程中，SQSTM1/p62的水平與自噬水平呈負(fù)相關(guān)[29]，而當(dāng)自噬小體與溶酶體形成受阻時(shí)，自噬小體的降解受阻，LC3Ⅱ和SQSTM1/p62則會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積。我們的結(jié)果表明，芍藥苷可通過(guò)降低LC3Ⅱ的表達(dá)，促進(jìn)p62蛋白的降解，來(lái)促進(jìn)H2O2損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞自噬，進(jìn)而可能在一定程度上改善細(xì)胞的狀態(tài)。

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