miR-486-5p的靶基因預(yù)測及其在胰腺腺癌中作用的生物信息學(xué)分析

任天宇，周新童，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

胰腺癌是癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一，是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，其主要病理類型為胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），5年生存率約為5%[1-2]。由于胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時已屬晚期，預(yù)后較差。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼小RNA，其作為天然的調(diào)控分子在細(xì)胞增殖分化、凋亡、代謝、微血管形成及腫瘤的發(fā)生等生物過程中發(fā)揮重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅可以作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，還可以用作潛在的治療靶標(biāo)[4-5]。

miR-486-5p 是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼單鏈RNA，有研究顯示miR-486-5p在多種腫瘤，如甲狀腺乳頭狀癌[6]、結(jié)直腸癌[7]及肺癌[8]等腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，表明其作為一種抑癌因子可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤，并通過靶向調(diào)節(jié)下游的靶基因和信號通路而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，有關(guān)miR-486-5p在胰腺癌中的作用及調(diào)控機(jī)制研究甚少。

本研究運用生物信息學(xué)方法，研究miR-486-5p對PAAD患者預(yù)后的影響，同時綜合運用多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測并篩選其調(diào)控的下游靶基因，同時對靶基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集、京都基因和基因組途徑百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，查找其可能存在的生物學(xué)功能，再通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶基因，并在公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗證篩選出核心基因。這將有助于更深入地研究miR-486-5p在PAAD發(fā)生發(fā)展中的作用，評估m(xù)iR-486-5p在PAAD中的臨床意義和診斷價值，為研究PAAD發(fā)生、發(fā)展的作用和相關(guān)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR-486-5p 在PAAD 中的生存分析

PROGmiRV2[9]公共數(shù)據(jù)庫包含不同類型癌癥的miRNA的預(yù)后數(shù)據(jù)。使用PROGmiRV2比較了miR-486-5p高表達(dá)和低表達(dá)PAAD患者的總體生存期。

1.2 miR-486-5p 靶基因的預(yù)測

使用在線靶基因預(yù)測工具DIANA tools[10]、HOCTAR[11]、miRDB[12]、Target Scan[13]、star Base[14]共5 個數(shù)據(jù)庫按照默認(rèn)參數(shù)預(yù)測靶基因，并繪制韋恩圖，篩選出至少在3個數(shù)據(jù)庫中都存在靶向關(guān)系的基因用于后續(xù)分析。

1.3 GO 富集分析與KEGG 信號通路分析

DAVID[15]（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）生物信息數(shù)據(jù)庫整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。將靶基因上傳到DAVID數(shù)據(jù)庫中，通過富集注釋，最終得到靶向基因及所參與的相關(guān)信號通路。以P＜0.05為閾值，得到統(tǒng)計學(xué)上有意義的GO注釋項和KEGG信號通路。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

使用STRING[16]數(shù)據(jù)庫構(gòu)建miR-486-5p靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，為了探索功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape軟件將其可視化，然后使用MCODE插件基于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)找到PPI中最密集連接的區(qū)域，從而識別miR-486-5p的關(guān)鍵靶基因。

1.5 關(guān)鍵基因的表達(dá)驗證及生存分析

GEPIA[17]在線工具包括了多種癌癥患者的TCGA和GTEx存活數(shù)據(jù)，通過GEPIA評估m(xù)iR-486-5p 的關(guān)鍵靶基因的臨床預(yù)后意義，繪制Kaplan-Meier生存曲線，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-486-5p 在PAAD 中的生存分析

通過在PROGmiRV2中比較miR-486-5p在PAAD中高低表達(dá)生存數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中高表達(dá)患者的總體生存時間優(yōu)于低表達(dá)患者（P＜0.05），從而認(rèn)為miR-486-5p可作為PAAD的一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖1）。

圖1 PROGmiRV2 中miR-486-5p 表達(dá)對PAAD 患者總生存率的影響Figure 1 The influence of miR-486-5p expression on overall survival in PAAD patients from PROGmiRV2

2.2 miR-486-5p 靶基因預(yù)測

利用DIANAtools、HOCTAR、miRDB、TargetScan、starBase 5個在線數(shù)據(jù)庫篩選出的靶基因數(shù)目分別為557、409、332、167、757，取并集共得到1 540個基因，對上述結(jié)果繪制Venn圖（圖2），得到至少被3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的靶基因數(shù)目共187個。

圖2 miR-486-5p 的預(yù)測靶基因個數(shù)Figure 2 Number of the predicted target genes of miRNA-486-5p

2.3 靶基因功能和通路途徑分析

利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的靶基因進(jìn)行GO功能富集以及KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)靶基因涉及蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)及凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，富集在細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)及細(xì)胞膜等細(xì)胞組分（表1）。通過KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)基因主要參與FOXO信號通路、p53信號通路、Ras信號通路和PI3K-Akt等信號通路（表2）。

表1 miR-486-5p 預(yù)測靶基因的GO 富集分析Table 1 GO enrichment analysis of the predicted target genes of miR-486-5p

表2 miR-486-5p 預(yù)測靶基因KEGG 信號通路分析Table 2 KEGG pathway analysis of the predicted target genes of miR-486-5p

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

為了研究靶基因在PAAD中的作用機(jī)制，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對miR-486-5p靶基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖并將其可視化（圖3），發(fā)現(xiàn)了一些在PAAD調(diào)控中起關(guān)鍵作用的基因，如SIRT1、PTEN、SMAD2、CSNK2A1及SERPINE1等。

圖3 miR-486-5p 靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Figure 3 The PPI network constructed with the target genes of miR-486-5p

2.5 GEPIA 核心基因驗證及生存分析

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn)，CSNK2A1和SERPI NE1水平在PAAD組織表達(dá)中高于正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）（圖4）。生存分析發(fā)現(xiàn)CSNK2A1和SERPINE1基因的表達(dá)量與患者的總體生存時間和無病生存時間均密切有關(guān)（均P＜0.05）（圖5）。

圖4 CSNK2A1 和SERPINE1 在PAAD 組織及正常組織中的表達(dá)差異Figure 4 Differential expressions of CSNK2A1 and SERPINE1 in PAAD tissues and normal tissues

圖5 CSNK2A1 和SERPINE1 與PAAD 患者預(yù)后的關(guān)系Figure 5 Relations of CSNK2A1 and SERPINE1 with the prognosis of PAAD patients

3 討 論

PAAD是惡性程度最高的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率與致死率近乎持平[18]，手術(shù)切除是唯一可能根治的治療方法，近年來盡管胰腺癌的外科治療取得了長足的進(jìn)步，圍手術(shù)期病死率和術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率均顯著下降，但其手術(shù)切除率和遠(yuǎn)期療效仍不盡人意[19]。提高PAAD早期確診率、找出分子標(biāo)志物以改善PAAD的治療效果是目前急需解決的問題。

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后參與基因調(diào)控的小型非編碼RNA家族，現(xiàn)被公認(rèn)為是各種癌癥的重要干預(yù)目標(biāo)和預(yù)測工具。目前已有多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA在PAAD中的重要作用及機(jī)制[20-22]。miR-486-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼單鏈RNA，最近有研究[23]發(fā)現(xiàn)，血清中的miR-486-5p可作為宮頸癌的診斷標(biāo)志物，Mohamed等[24]發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在低表達(dá)肺癌中預(yù)后較差，并與分期顯著相關(guān)，可作為肺癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。盡管miR-486-5p在癌癥上具有如此多的功能，尚缺乏miR-486-5p在PAAD中的研究報告。

為了更好地了解miR-486-5p的生物學(xué)功能，本研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在腫瘤組織中高表達(dá)患者的總體生存時間優(yōu)于低表達(dá)患者（P＜0.05），結(jié)果表明miR-486-5p低表達(dá)是導(dǎo)致PAAD患者不良預(yù)后的因素。

本研究綜合多個靶基因預(yù)測工具篩選miR-486-5p的靶基因，進(jìn)一步對得到的靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)及凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，同時顯著富集在FOXO信號通路、p53信號通路、Ras信號通路及PI3KAkt等信號通路，表明miR-486-5p通過多基因及多途徑影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

對靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)的分析，本研究篩選出SIRT1、PTEN、SMAD2、CSNK2A1及SERPINE1等多個關(guān)鍵基因，其中PTEN[25]、SMAD 2[26]、SIRT1[27]已被證實作為miR-486-5p的靶基因?qū)е掳┌Y的進(jìn)展。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗證關(guān)鍵基因，我們發(fā)現(xiàn)CSNK2A1和SERPINE1表達(dá)水平在PAAD組織顯著高于正常胰腺組織。其中CSNK2A1被證明[28]可以通過介導(dǎo)SIRT6磷酸化參與乳腺癌的進(jìn)展，是乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。根據(jù)功能分析結(jié)果，我們可以推測它可能通過磷酸化蛋白質(zhì)參與胰腺癌的進(jìn)展。有研究[29]發(fā)現(xiàn)SERPINE1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的一類，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲以及耐藥[30-32]。生存分析發(fā)現(xiàn)CSNK2A1和SERPINE1基因的表達(dá)量與患者的總體生存時間和無病生存時間均密切相關(guān)（P＜0.05），這表明它們對PAAD患者的預(yù)后有著不良的影響，可作為胰腺癌的潛在治療靶點以改善預(yù)后。

總之，本研究查找了miR-486-5p的靶基因以及其激活的相關(guān)信號通路，這些發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解PAAD中潛在的生物學(xué)機(jī)制。癌組織中miR-486-5p低表達(dá)患者的總體存活率可為PAAD診斷和治療提供依據(jù)。同時本研究篩選的基因也為PAAD的早期診斷與分子治療提供了潛在的標(biāo)志物和靶點。雖然本研究獲得了一些有意義的見解，但仍存在一些局限性，如樣品來源不同，數(shù)據(jù)庫中miR-486-5p在PAAD表達(dá)作用仍然不明確。因此，需要更深入的體內(nèi)或體外實驗研究來驗證miR-486-5p在PAAD中的作用及機(jī)制。