ctDNA檢測及靶向藥物在非小細胞肺癌中的應(yīng)用

劉垚 錢有輝

摘要：非小細胞肺癌（NSCLC）為最常見的肺癌病理類型，約占肺癌總數(shù)的 85%。近年來隨著對NSCLC生物學及腫瘤發(fā)展機制的深入研究，關(guān)于NSCLC的早期檢測及靶向治療也取得了明顯進步。在早期檢測領(lǐng)域，ctDNA檢測作為一種非侵入性的NSCLC檢測方法受到了廣泛的關(guān)注，多項研究表明ctDNA有望作為腫瘤細胞檢測的可靠生物標志物。在NSCLC治療領(lǐng)域，多種以酪氨酸激酶抑制劑和免疫治療為基礎(chǔ)的藥物逐步推廣應(yīng)用，這些藥物顯著提高了患者的無進展生存期和總生存率。本文主要從NSCLC的ctDNA檢測及靶向治療展開論述，探討ctDNA的聚合酶鏈式反應(yīng)和測序檢測以及靶向治療和免疫治療在NSCLC中的應(yīng)用，旨在為NSCLC診斷及治療提供參考。

關(guān)鍵詞：非小細胞肺癌;ctDNA檢測;靶向治療;酪氨酸激酶抑制劑;免疫治療

中圖分類號：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.013

文章編號：1006-1959（2020）11-0038-04

Abstract：Non-small cell lung cancer （NSCLC） is the most common type of lung cancer pathology， accounting for approximately 85% of the total number of lung cancers. In recent years， with the in-depth study of NSCLC biology and tumor development mechanism， the early detection and targeted therapy of NSCLC has also made significant progress. In the early detection field， ctDNA detection has received widespread attention as a non-invasive NSCLC detection method， and many studies have shown that ctDNA is expected to be a reliable biomarker for tumor cell detection. In the field of NSCLC therapy， a variety of drugs based on tyrosine kinase inhibitors and immunotherapy have been gradually promoted and applied. These drugs have significantly improved the progression-free survival and overall survival of patients. This article mainly discusses the detection of ctDNA and targeted therapy of NSCLC， and discusses the application of polymerase chain reaction and sequencing detection of ctDNA and the application of targeted therapy and immunotherapy in NSCLC.

Key words：Non-small cell lung cancer;ctDNA detection;Targeted therapy;Tyrosine kinase inhibitor;Immunotherapy

肺癌（lung cancer）是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，大部分患者確診時已處于晚期，手術(shù)切除是Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲa期非小細胞肺癌（NSCLC）最有效的療法，但晚期肺癌患者治療預后仍不理想[1]。因大多數(shù)患者在診斷時存在轉(zhuǎn)移性病灶，因此長期生存期的改善需要更有效的全身治療。目前，肺癌的主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療，其中靶向治療藥物具有臨床效果顯著、不良反應(yīng)少的優(yōu)點，被越來越多學者們所認可[2]。ctDNA是一種可重復性的無創(chuàng)“液體活檢”診斷技術(shù)，對癌癥特異性分子改變的檢測有重要意義[3]，且在一定程度上避免了腫瘤的異質(zhì)性[4]。本文主要就NSCLC的非侵入性ctDNA檢測及靶向治療進行綜述，以期為NSCLC的診斷及治療提供參考。

1 ctDNA與非小細胞肺癌

腫瘤患者檢測最直接的臨床樣本是腫瘤組織，但由于腫瘤異質(zhì)性的存在，單憑位點穿刺或活檢不能反映腫瘤的全貌，而通過手術(shù)采集患者腫瘤組織進行檢測存在一定的風險[5]。循環(huán)無細胞腫瘤衍生DNA （circulating cell-free tumour-derived DNA，ctDNA）是由腫瘤細胞產(chǎn)生，釋放到血液中游離存在的DNA。ctDNA的檢測作為一種非侵入性的非小細胞肺癌檢測方法，在癌癥的診斷及檢測方面受到了廣泛的關(guān)注，多項研究表明ctDNA有望作為腫瘤細胞檢測的可靠生物標志物，是一種更為精確、靈敏的檢測標記物[6]。ctDNA檢測最大的挑戰(zhàn)是有效區(qū)分人源背景DNA與腫瘤DNA。在樣本中，因存在大量人源DNA，因此需要更為靈敏的方法來識別ctDNA[5]。ctDNA檢測方法主要分為測序法和聚合酶鏈式反應(yīng)衍生方法（polymerase chain reaction，PCR），包括突變擴增阻滯系統(tǒng)（Amplified Refractory Mutation System PCR，ARMS PCR）、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）、新一代測序（Next generation sequencing，NGS）等[6]。

1.1 ARMS PCR ?ARMS是一種在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測已知點突變的方法，也稱為等位基因特異擴增法[7]。其主要操作方法是設(shè)計兩個5'端引物，一個與突變DNA互補，一個與正常DNA互補，僅當靶等位基因存在時，擴增才能正常進行。目前基于ARMS檢測ctDNA的試劑盒已經(jīng)被國家藥監(jiān)局批準使用，實現(xiàn)了對稀有突變的檢測，具有較高的敏感性與特異性。Zhang Q等[7]使用ARMS PCR檢測非小細胞肺癌中表皮生長因子EGFR基因突變，證實了ARMS PCR是一種快速、靈敏的檢測方法。靈敏度、特異性和一致率被認為是腫瘤組織突變檢測的金標準，Cabanero M等[8]研究顯示，ARMS的靈敏度在50%～75%，特異性在85%～100%，一致性在72.7%～94.3%，遠高于常規(guī)PCR技術(shù)。

1.2 dPCR ?dPCR是另一種定向檢測 ctDNA 的方法，通過將一個PCR反應(yīng)分成多個較小的反應(yīng)來量化ctDNA，包括微滴式數(shù)字PCR、乳液PCR和chip-PCR[8]。它實現(xiàn)了對變異基因的絕對定量，提高了檢測的靈敏度與特應(yīng)性。Oxnard GR等[9]使用dPCR檢測了接受奧西替尼治療獲得性EGFR耐藥患者的T790M基因的突變存在，結(jié)果顯示其靈敏度為66%～92%，特異性為87%～100%，一致性為70%～93%，靈敏度稍高于ARMS法[10，11]。

1.3 NGS ?基于寡聚核苷酸DNA的靶向測序作為一種更為經(jīng)濟實惠的方法已經(jīng)用于靶基因面板甚至是人類外顯子組的測序。NGS的出現(xiàn)變革了基因組測序領(lǐng)域的發(fā)展，極大的降低了測序成本，使基因組測序技術(shù)不再受限于昂貴的價格。NGS依賴于文庫的構(gòu)建，通常ctDNA因為基因片段較短，所以化學法即可滿足其文庫的制備。Chin RI等[12]開創(chuàng)性的使用NGS對NSCLC患者的ctDNA進行定量，通過生物信息學的方法，比對癌癥細胞突變庫及癌癥基因庫，靶向定位139個復發(fā)基因突變序列，涉及521個外顯子和13個內(nèi)含子，覆蓋的基因長度約為125kb，并能準確的識別缺失、點突變及結(jié)構(gòu)改變。該研究表明，ctDNA分析能更好地檢測早期癌癥，并可用于區(qū)分殘留病變和治療相關(guān)變化。外顯子全基因組測序不需要先驗的腫瘤分子特征，Perdigones N等[13]利用外顯子測序監(jiān)測6例晚期肺癌、乳腺癌及卵巢癌患者的治療反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤組織和ctDNA中基因突變存在極高的一致性。然而全基因組測序因為成本較高，限制了該方法在腫瘤ctDNA檢測中的實用性。

由于大多數(shù)NSCLC患者確診時已經(jīng)處于肺癌晚期，因此通過手術(shù)方法進行的組織活檢對一些患者往往是不可行的，ctDNA檢測作為一種非侵入性的診斷技術(shù)，在不能進行組織活檢、高并發(fā)風險及耐藥性效果監(jiān)測的患者中發(fā)揮著越來越重要的作用[14]。在實際應(yīng)用中，ARMS和ddPCR具有較高的特異性及一致性，但靈敏度較低。NGS作為新興檢測方法，在該領(lǐng)域的優(yōu)勢已經(jīng)得到顯現(xiàn)，但是對于ctDNA拷貝數(shù)較低的樣本，NGS仍具有較大的挑戰(zhàn)，如何精準、高效識別低拷貝的ctDNA將會大幅度提高檢測的靈敏度。此外，該方法在一定程度上依賴于生物信息學分析，因此生物信息學分析工具及方法的進步會在一定程度上提高其檢測的特異性。

2靶向藥物治療

近年來，NSCLC的治療策略逐漸從經(jīng)驗性化療演變?yōu)榛诮M織學和分子標志物的個性化診療方案。目前已在高達60%的肺腺癌和50%～80%的肺鱗癌中發(fā)現(xiàn)了致癌驅(qū)動基因的突變，其直接導致腫瘤生長、增殖。NSCLC的靶向治療針主要針對這些突變蛋白激酶或受體產(chǎn)物，以受體單克隆抗體（Monoclonal antibodies，mAb）或酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）的形式出現(xiàn)。常見治療靶點為表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）。多項研究證明靶向治療對晚期肺癌患者有明顯的臨床效益，同時免疫治療有利于宿主免疫系統(tǒng)識別癌癥為外來物，刺激免疫系統(tǒng)，解除允許疾病生長和擴散的抑制[15]。

2.1受體酪氨酸激酶 ?受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）是一種跨膜糖蛋白，與配體結(jié)合后激活眾多的細胞內(nèi)通路，在正常代謝過程中具有重要作用，如細胞增殖和分化。RTK 在許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中也具有關(guān)鍵作用。RTK包括 ALK 受體、表皮生長因子 （Epidermal growth factor，EGF） 和血管內(nèi)皮生長因子[16]。

2.1.1 EGFR TKI類藥物 ?EGFR作為酪氨酸激酶受體ErbB家族的主要成員，是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物。EGFR突變常見于肺腺癌中，最常見的突變是外顯子19的缺失及外顯子21的點突變。針對 EGFR的靶向治療可使得下游信號通路的傳導抑制，實現(xiàn)抑制癌癥的效果，目前治療NSCLC通常使用EGFR TKI類藥物[12]。常見的治療藥物有阿法替尼、吉非替尼等，這些藥物增了細胞凋亡，抑制細胞生長、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。多項研究多項研究已證實 EGFR TKI類藥物對晚期EGFR突變的肺癌的治療療效，有研究顯示，在未經(jīng)治療的晚期（ⅢB或Ⅳ期）肺腺癌患者中，吉非替尼的治療效果優(yōu)于卡鉑-紫杉醇化療。在EGFR 陽性患者中，吉非替尼組的無進展生存期顯著長于化療組;在EGFR陰性患者中，化療組的無進展生存期顯著延長。耐藥性是EGFR TKI治療的挑戰(zhàn)之一，最常見的是通過T790M繼發(fā)獲得性 EGFR 突變。在T790M中，蛋氨酸取代了EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域790位的蘇氨酸，并降低了第一代厄洛替尼、吉非替尼和第二代阿法替尼EGFR TKI 的有效性。第三代 EGFR TKI奧希替尼對T790M1晚期 NSCLC 有效[18]。

2.1.2 ALK TKI類藥物 ?ALK編碼跨膜受體酪氨酸激酶，在7%的NSCLC患者中，ALK基因與棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（Echinoderm microtubule-associated protein like 4，EML4）基因融合，產(chǎn)生EML4-ALK 融合癌基因。EML4-ALK 融合癌基因也稱為 ALK 重排，能促進細胞生長和增殖。ALK 重排常見于年輕的腺癌患者，ALK TKI類藥物克唑替尼是ALK陽性NSCLC的首選治療藥物，也是全球首個口服EML4-ALK融合基因抑制劑。對克唑替尼耐藥或不能耐的患者可使用第二代ALK抑制劑，如色瑞替尼、艾樂替尼、布加替尼。在既往接受過治療和未接受過治療的患者中，與細胞毒性治療相比，克唑替尼可改善中位無進展生存期[19]。大多數(shù)既往接受克唑替尼治療的患者也可從第二代ALK抑制劑中獲益，與一線細胞毒治療相比，色瑞替尼可延長ALK陽性NSCLC中位無進展生存期[20]。

2.1.3 ROS1類藥物 ?ROS1編碼受體酪氨酸激酶，當重排導致其酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與伴侶基因。由于 ROS1 和 ALK 激酶結(jié)構(gòu)域之間的高度同源性，用于治療 ALK 陽性腫瘤的藥物包括克唑替尼，色瑞替尼和氯拉替尼在 ROS1陽性腫瘤中也顯示出明顯的活性。

2.2免疫治療 ?靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原-4 （cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4） 的單克隆抗體及免疫阻斷劑（immune checkpoint blockers，ICBs）標志著肺癌治療護理的一個新方向。美國 FDA 批準的首個ICB是易普利姆瑪（ipilimumab），是一種阻斷 CTLA-4 的人免疫球蛋白G1單克隆抗體，可用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[21]。在腫瘤發(fā)生過程中，PD-1信號轉(zhuǎn)導主要由腫瘤內(nèi) PD-L1的適應(yīng)性表達驅(qū)動，使識別腫瘤特異性抗原的 T 細胞失活，允許腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。用抗體阻斷 PD-1和 PD-L1軸為恢復T細胞介導的抗腫瘤免疫提供了一種方法[22]。多項研究顯示，大量NSCLC患者在使用ICB類藥物后獲益。目前獲批或正在開發(fā)用于NSCLC的ICB類藥物包括抗PD-1人源IgG4納武單抗（nivolumab）和派姆單抗（pembrolizumab），以及抗 PD-L1人源抗體阿特朱單抗（atezolizumab）等[23]。ICB已被批準作為一線藥物治療晚期 NSCLC 患者，在鉑類藥物細胞毒治療期間或之后發(fā)生疾病進展的轉(zhuǎn)移性 NSCLC 患者中，與多西他賽治療相比，納武單抗治療的中位生存期顯著延長。與多西他賽治療相比，ICB藥物治療后總生存期得到改善。在一線 NSCLC 治療中，已將帕博利珠單抗確立為腫瘤 PD-L1 表達水平≥50%的晚期或轉(zhuǎn)移性 NSCLC 患者的新標準治療。在這些患者中，與含鉑細胞毒性治療相比，帕博利珠單抗可顯著改善無進展生存期和總生存期[24]。相比之下，在 PD-L1 表達水平≥5%的患者中，與細胞毒性治療相比，納武單抗治療與無進展生存期或總生存期的改善無關(guān)[25]。

3總結(jié)

隨著非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展的機制不斷被揭示，其診斷及治療也發(fā)生了巨大的變化。ctDNA檢測NSCLC患者EGFR基因，可有效監(jiān)測靶向藥物治療的臨床效果，為肺癌晚期患者的分子診斷提供了“液體活檢”的可能。但該方法尚處于起步階段，ctDNA檢測靈敏度、檢測的成本和時效問題是該領(lǐng)域亟待解決的問題。此外，對NSCLC腫瘤生物學的深層理解使靶向治療的發(fā)展成為可能，預示著個性化醫(yī)療時代的到來。隨著口服EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的引入，NSCLC患者開始接受分子靶向治療。ICB治療方法的引入延長了患者的生存期，靶向藥物的低毒性、高效性的優(yōu)勢，為晚期NSCLC患者的治療提供新的思路：晚期NSCLC患者可通過檢測驅(qū)動基因，選擇針對突變基因的靶向藥物，最終實現(xiàn)了精準治療、改善預后。未來，相信隨著ctDNA檢測及靶向藥物治療的進一步發(fā)展，會有越來越多NSCLC患者從ctDNA檢測及靶向治療中獲益。

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收稿日期：2020-03-11;修回日期：2020-04-18

編輯/成森