新型冠狀病毒肺炎的分子診斷技術(shù)及其防控措施

王新宙 任曼 候彥州

摘要：新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起，是一種具有高度傳染性的疾病。全球已有多個國家和地區(qū)暴發(fā)大規(guī)模COVID-19疫情，尤其是無癥狀感染者具傳染性使得疫情防控更加的復(fù)雜和嚴(yán)峻。COVID-19尚無疫苗和特效藥，盡早確診并進(jìn)行隔離和支持治療是現(xiàn)階段最有效的措施。目前COVID-19的病原學(xué)檢測主要以核酸檢測為主，同時結(jié)合臨床表現(xiàn)、血清學(xué)免疫檢測等可明確診斷。本文主要介紹分子診斷技術(shù)在COVID-19診斷中的應(yīng)用，并梳理了目前的防控措施，旨在為疫情的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒肺炎;分子診斷;防控措施

中圖分類號：R563.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.010

文章編號：1006-1959（2020）11-0027-04

Abstract：The novel coronavirus pneumonia （COVID-19） is caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2）， and is a highly contagious disease. There have been large-scale outbreaks of COVID-19 outbreaks in many countries and regions around the world， especially the asymptomatic infections are infectious， making the outbreak prevention and control more complicated and grim. COVID-19 has no vaccines and specific drugs， and early diagnosis and isolation and supportive treatment are the most effective measures at this stage. At present， the pathogenic detection of COVID-19 is mainly based on nucleic acid detection， and the diagnosis can be confirmed by combining clinical manifestations and serological immunoassay. This article mainly introduces the application of molecular diagnosis technology in the diagnosis of COVID-19， and combs the current prevention and control measures， aiming to provide reference for the prevention and control of epidemic situation.

Key words：Novel coronavirus pneumonia;Molecular diagnosis;Prevention and control measures

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起[1]。SARS-CoV-2是屬于β屬的冠狀病毒，呈球形或橢圓形，外層包膜上有棘突，電鏡下呈皇冠狀。SARS-CoV-2與SARS病毒的相似度約為79%，均通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）介導(dǎo)入侵人體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)[2]，SARS-CoV-2與ACE2的結(jié)合力約為SARS病毒的4倍，這可能也是COVID-19比SARS傳染性更強的原因之一。美國約翰斯·霍普金斯大學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[3]，截止2020年3月30日，全球新冠肺炎確診病例已超78萬例，累計死亡逾3.7萬例。SARS-CoV-2對人類而言是一種全新的病毒，其疫苗和特效藥還在研制中，提早診斷盡早隔離治療是目前防治COVID-19最有效的措施。為此，本文對COVID-19的分子診斷技術(shù)和防控措施進(jìn)行梳理，以期提高對COVID-19的認(rèn)識，為疫情的有效控制提供理論依據(jù)。

1分子診斷技術(shù)在防控SARS-CoV-2 感染中的應(yīng)用

1.1核酸檢測 ?目前，SARS-CoV-2核酸檢測方法主要包括高通量測序、PCR法、恒溫擴增法、CRISPR檢測法等。2020年1月17日，WHO公布《疑似2019新型冠狀病毒感染病例實驗室檢測臨時指南》[4]，權(quán)威指南建議：①收集上呼吸道樣本、下呼吸道樣本和血清樣本等;②通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）進(jìn)行COVID-19核酸檢測;③僅在無法使用RT-PCR時建議使用血清學(xué)檢測;④確診患者在治療過程中也應(yīng)重復(fù)收集呼吸道樣本用于核酸檢測，以便確認(rèn)病毒是否清除;⑤核酸檢測在生物安全第二等級（BSL-2）設(shè)施中進(jìn)行。實時熒光定量RT-PCR不僅是官方認(rèn)可的SARS-CoV-2測定方法，也是目前的主流檢測方法。中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第二版）》建議實時熒光RT-PCR對病毒基因開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）同時進(jìn)行檢測，同一份樣本2個靶基因檢測結(jié)果均為陽性方可確診[5]。目前，已有多家公司研制出基于實時熒光定量RT-PCR的新型冠狀病毒核酸診斷試劑盒，其中圣湘生物、達(dá)安基因、明德生物等公司的的試劑盒已通過國家藥監(jiān)局的審批。另外，各類核酸快速檢測試劑也在此次抗疫中發(fā)揮重要作用，其中杭州優(yōu)思達(dá)（恒溫擴增-實時熒光法）、安邦生物（雜交捕獲免疫熒光法）、上海仁度（RNA捕獲探針法）的3款新冠病毒核酸快速檢測產(chǎn)品已通過中國國家藥監(jiān)局的應(yīng)急審批。雅培開發(fā)的基于核酸等溫擴增技術(shù)ID NOW平臺的新型冠狀病毒病的分子即時檢測在5 min即可獲得檢測結(jié)果，目前也已獲得美國FDA授予的緊急使用授權(quán)。

1.2血清免疫學(xué)檢測 ?目前投入使用的核酸檢測試劑盒需要依賴相關(guān)PCR實驗室及昂貴儀器，不合適供現(xiàn)場即時檢測（POCT）。此外，基于熒光定量PCR法的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒用時基本至少在1～2 h，不適用于對乘客進(jìn)行大規(guī)模檢查，因為測試耗時較長，此類措施會阻礙正常運營。而基于等溫擴增技術(shù)的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒操作簡便，耗時一般在15 min左右，但需配備濁度儀檢測以減少氣溶膠污染，對引物要求高易造成假陽性，且LAMP屬于日本專利，試劑開發(fā)受到限制，成本較高不適宜大規(guī)模排查檢測。針對目前COVID-19疫情的防控，亟需一種檢測準(zhǔn)確，用時短，操作簡單，成本較低，無需大型儀器的檢測方法，用于在交通樞紐人群以及對密切接觸人群進(jìn)行大規(guī)模的初篩排查。

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》將血清檢測納入COVID-19的確診依據(jù)[6]。膠體金免疫層析檢測技術(shù)，是以膠體金作為標(biāo)記物應(yīng)用于抗原抗體檢測的一種側(cè)向流免疫層析技術(shù)，通常用血清或血漿作為檢測樣本，在免疫學(xué)中己應(yīng)用于多種傳染病、寄生蟲感染等的檢測。該方法最大的特點就是便攜性和快速響應(yīng)性（15 min左右），操作簡便，可提供現(xiàn)場即時檢測（POCT），也不需要昂貴的儀器設(shè)備[7， 8]，定性檢測時肉眼即可判讀結(jié)果[9]。而且血清、血漿作為檢測樣本，血液樣本采集便捷，一般血液樣本含毒量低或者不含病毒，可以大大降低醫(yī)護(hù)人員被感染風(fēng)險。特別適合于廣大出入境檢驗檢疫機構(gòu)、醫(yī)院、檢疫局等需要快速大規(guī)模檢測和大范圍普查。截至2020年3月30日，國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)5個基于膠體金層析法的COVID-19血清學(xué)檢測試劑盒，分別為和信健康、諾唯贊、廣州萬孚、英諾特、珠海麗珠。

2疫情防控措施

傳染病的流行是指病原體由感染者排出后，經(jīng)歷適合的傳播途徑，再侵入易感者而形成新的感染，并不斷蔓延擴大的過程。這其中涉及3個基本環(huán)節(jié)，即傳染源、傳播途徑和易感者。防控疫情的基本原則就是隔離傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感人群。

2.1傳染源 ?國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》中首次明確，COVID-19傳染源除了SARS-CoV-2感染的患者，無癥狀感染者也可能成為傳染源[10]，這也使得疫情防控的形勢更加嚴(yán)峻。無癥狀感染者是指那些沒有明顯COVID-19相關(guān)臨床癥狀，而呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2病原學(xué)檢測陽性的患者。目前無癥狀感染者具有傳染性是明確的，對于其是否具有較高傳染性，正在研究中。Wlfel R等[11]研究顯示，臨床癥狀最輕時是患者釋放大量病毒傳染性最強的時期。Zou LR等[12]研究顯示，17例COVID-19患者發(fā)病初期即檢測到高數(shù)值的病毒載量，而研究病例所涉及的另一名無癥狀COVID-19感染者釋放的病毒量與其他COVID-19患者相當(dāng)。隨著國內(nèi)疫情防控態(tài)勢的發(fā)展，無癥狀感染者成為現(xiàn)階段的重要監(jiān)測目標(biāo)之一。2020年4月1日，我國衛(wèi)健委首次將無癥狀感染者病例的數(shù)據(jù)列入每日通報，截至4月6日24時，接受醫(yī)學(xué)觀察的無癥狀感染者為1033例[13]。無癥狀感染者的比例是流行病學(xué)的一個非常重要的參數(shù)，是衡量病毒傳播潛力的重要統(tǒng)計指標(biāo)，為確認(rèn)傳染病的社會隔離策略的強度和范圍提供依據(jù)。研究人員對鉆石公主號郵輪上的COVID-19無癥狀感染者比例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)確診病例中有17.9%屬于無癥狀感染者[14]。另有研究顯示[15]，于2020年2月從武漢撤離的日本公民中，有4例（31%）確診病例為無癥狀感染者?！禢ature》對此發(fā)表特別報告——隱藏感染者（因癥狀輕微或無癥狀未做SARS-CoV-2或記錄）可能會導(dǎo)致新的疫情爆發(fā)[16]。

鑒于當(dāng)前我國國內(nèi)新發(fā)COVID-19病例數(shù)已經(jīng)基本控制在較低水平，且多以境外輸入為主，嚴(yán)格對境外輸入人群（尤其疫情爆發(fā)地區(qū)）進(jìn)行SARS-CoV-2檢測，有效隔離觀察，做好病例溯源，是目前隔離傳染源的有效措施。

2.2傳播途徑 ?做好個人防護(hù)，切斷SARS-CoV-2的傳播途徑，能有效避免SARS-CoV-2感染。目前發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2具有較強的人際傳播能力，主要通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，密閉空間內(nèi)存在氣溶膠傳播的風(fēng)險[6]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎公眾防護(hù)指南（第二版）》[17]，盡量避免到疾病流行地區(qū)、減少到人流量大的公共場所，建議外出佩戴口罩，重視個人衛(wèi)生和習(xí)慣，保持社交距離，并且做好健康監(jiān)控，是最有效的個人防護(hù)措施。4月4日，美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）對《新冠肺炎疫情公眾預(yù)防指南》做出修訂，建議美國民眾在公共場合都要戴上布制口罩，以免傳播冠狀病毒。近日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究團(tuán)隊首次在恒河猴模型證實了SARS-CoV-2能通過結(jié)膜途徑進(jìn)行傳播;SARS-CoV-2感染結(jié)膜1 d后即可在恒河猴的呼吸道和其他組織檢測到病毒[18]，表明在疫情預(yù)防中需提高對眼睛保護(hù)的重視，尤其是醫(yī)護(hù)人員等高風(fēng)險人群，應(yīng)盡量佩戴護(hù)目鏡。

除了個人防護(hù)，《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第六版）》建議，全國分區(qū)分級精準(zhǔn)防控，強化對重點場所（超市、機場、公共衛(wèi)生間等公共場所和飛機、火車、地鐵等公共交通工具）、機構(gòu)（醫(yī)院、學(xué)校等）的通風(fēng)、消毒和體溫檢測等措施[19]。Ong SWX等[20]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境是SARS-CoV-2潛在的傳播媒介，定期消毒清潔能夠有效抑制病毒傳播。目前已在COVID-19患者糞便及尿液樣本檢測出SARS-CoV-2[6]，雖然消化道（糞-口）傳播途徑有待證實，但需做好排污措施，以杜絕可能經(jīng)下水道傳播的風(fēng)險。只有切斷SARS-CoV-2的傳播途徑，才能有效預(yù)防COVID-19的傳播。

2.3易感人群 ?目前認(rèn)為，人群普遍對SARS-CoV-2易感。Zhou F等[21]對武漢兩家醫(yī)院收治的191例COVID-19確診病例進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)年齡較大、有敗血癥癥癥狀、入院時有凝血問題等都使感染者的死亡風(fēng)險增加，此類人群應(yīng)注重防范，醫(yī)護(hù)人員對于此類患者也應(yīng)注意其可能存在預(yù)后不良風(fēng)險。雖然官方發(fā)布指南明確指出所有人群都對SARS-CoV-2敏感，但從實際數(shù)據(jù)來看，兒童患COVID-19的比例比成人更低。2020年4月6日，美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）最新發(fā)布的一項針對兒童感染SARS-CoV-2病例的研究[22]，結(jié)果顯示，兒童比成人更不容易出現(xiàn)COVID-19癥狀。王端等[23]對31例兒童SARS-CoV-2感染者反復(fù)檢查后發(fā)現(xiàn)，其中7例兒童（4例無癥狀型，3例亞臨床型）無臨床癥狀及明顯陽性體征。與普通呼吸道感染相比，兒童感染SARS-CoV-2的臨床癥狀及體征無明顯特異性，甚至可無臨床癥狀。因此，不可忽視對于兒童的防護(hù)，同時，確定無癥狀兒童患者的傳播能力對于指導(dǎo)制定控制疾病流行措施具有重要意義。

3總結(jié)

目前COVID-19的疫苗和治療藥物還在研發(fā)中，盡早確診并進(jìn)行隔離和治療是現(xiàn)階段最有效的措施。在COVID-19病原學(xué)分子診斷方面，主要以核酸檢測為主，血清學(xué)免疫檢測為輔。核酸檢測最常用的方法是實時熒光RT-PCR技術(shù)，血清學(xué)免疫檢測多基于膠體金免疫層析檢測技術(shù)。面對此次COVID-19疫情的暴發(fā)，我國通過快速而有效的應(yīng)急反應(yīng)體系，再加上全國人民的積極響應(yīng)和配合，國內(nèi)新發(fā)COVID-19病例數(shù)已經(jīng)控制在較低水平。但近期境外輸入病例，特別是無癥狀感染者仍需加強檢測與關(guān)注。相信隨著新的診斷技術(shù)與診斷產(chǎn)品也將陸續(xù)出現(xiàn)，以及對新型冠狀病毒的進(jìn)一步了解、對疫情防控經(jīng)驗的進(jìn)一步總結(jié)，有關(guān)COVID-19的診治、防控措施將更加完善。

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收稿日期：2020-04-10;修回日期：2020-04-20

編輯/成森