氣相色譜-質(zhì)譜法分析酒花對(duì)葡萄酒香氣成分的影響

段麗麗，姜良珍，何蓮，田怡，王淑雅，楊曉儀，易宇文

（1.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川成都610100；2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都610100；3.四川旅游學(xué)院烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610100）

酒花，又稱忽布（hop）、啤酒花，一種草本蔓性植物，具有鎮(zhèn)定和抗菌的效用，是啤酒釀造流程中非常重要的原料之一[1-3]。酒花中含有酒花樹脂、酒花油以及多酚等物質(zhì)，帶給啤酒清爽苦味、芬芳香味，有利于啤酒的防腐以及增強(qiáng)啤酒的穩(wěn)定性。不同品種的酒花，能夠賦予酒不同的芬芳香氣和獨(dú)特的苦味[4-6]。法格酒花是英國(guó)培育的一種苦香兼優(yōu)，且含有較多石竹烯和法尼烯，具有木本和草本植物的香氣。

風(fēng)味化學(xué)中，常用的氣味分析檢測(cè)技術(shù)有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-聞嗅法（gas chromatographyolfactometry，GC-O）、電子鼻 （electronic nose，ENOSE），3種分析檢測(cè)技術(shù)各有所長(zhǎng)。GC-MS能夠定性定量確定樣品中的具體風(fēng)味物質(zhì)[7]，GC-O能夠確定樣品中具體風(fēng)味物質(zhì)的氣味[8]；E-NOSE能夠短時(shí)間迅速分析判別氣味之間的差異[9]。在實(shí)際研究工作中，GCMS是常用的一種經(jīng)典分析測(cè)試儀器，歷史悠久，在眾多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如食品[10-15]、環(huán)境[16-18]、農(nóng)業(yè)[19-21]等。

隨著時(shí)代的變化，我國(guó)傳統(tǒng)葡萄酒的風(fēng)味已不能滿足消費(fèi)者的需求[7]，開發(fā)不同風(fēng)味的葡萄酒勢(shì)在必行。酒花中含有多種風(fēng)味物質(zhì)能，能夠賦予啤酒豐富的風(fēng)味。而將酒花引入葡萄酒釀造，目前未見相關(guān)報(bào)道。為滿足消費(fèi)對(duì)葡萄酒的需求和豐富葡萄酒的產(chǎn)品線，結(jié)合啤酒花釀造新風(fēng)味的葡萄酒是我國(guó)葡萄酒發(fā)展的新趨勢(shì)。試驗(yàn)擬以不同濃度的法格酒花添加到葡萄酒釀造中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)為研究對(duì)象，以GC-MS為工具，結(jié)合主成分和感官評(píng)價(jià)等方法，探究其對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒花（法格）：市售；玫瑰香葡萄：成都金滿堂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；殼聚糖（粒度120目）：深圳天揚(yáng)生物科技有限公司；釀酒酵母：成都金滿堂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司選育；白砂糖：上海市糖業(yè)煙酒（集團(tuán)）有限公司。

PC-420D專用磁力加熱攪拌裝置；75 μm CAR/PDMS手動(dòng)萃取頭：美國(guó)Supelco公司；SQ680氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)PerkinElmer；FALLC4N電子天平：常州市衡正電子儀器有限公司；WK2102電磁爐：美的集團(tuán)有限公司；MY-50粉碎機(jī)：廣州市揚(yáng)鷹醫(yī)療器械有限公司；HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海廣地儀器設(shè)備有限公司。

1.2 酒花葡萄酒釀造的工藝流程

1.3 酒花葡萄酒釀造的工藝要點(diǎn)

1.3.1 酒花溶液制作

首先配置5種濃度梯度0.0 g/L（C00，即按市售葡萄酒的方法制備）、0.5 g/L（E01）、0.8 g/L（E02）、1.0 g/L（E03）和1.3 g/L（E04）的法格酒花溶液。取200 mL蒸餾水加熱至100℃，保持2 min，然后加入酒花溶液，熬制4 min，待酒花溶液充分冷卻后，再進(jìn)行過(guò)濾，備用。

1.3.2 葡萄酒的釀造

原料預(yù)處理：選擇成熟、新鮮、無(wú)腐爛的玫瑰香葡萄，去除異物，清洗干凈，然后去皮取果肉及葡萄籽。

主發(fā)酵：將果肉和果肉重量20%的酒花溶液同時(shí)放入發(fā)酵瓶中，接入1.0%活化后的酵母溶液，調(diào)整水浴鍋的溫度（20℃～25℃）。當(dāng)出現(xiàn)皮渣下沉，整罐酒體變渾濁，酒液基本沒有甜味時(shí)，則發(fā)酵結(jié)束，時(shí)間一般為6 d～8 d[22]。前期為控制樣品的酒精度，應(yīng)該按照要求調(diào)整加糖量，使得樣品的總糖度為22°。

后發(fā)酵：主發(fā)酵完成后，將漂浮在葡萄酒上方的雜質(zhì)過(guò)濾除去后繼續(xù)發(fā)酵（15℃、120 h）。

澄清：后發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，（2±2）℃低溫保藏168 h左右（168 h為一星期，本試驗(yàn)以一星期為一個(gè)周期，低溫下鹽結(jié)晶析出，過(guò)濾去除），有利于酵母的沉降。采用殼聚糖絮凝澄清法，殼聚糖用量為酒液量的0.05%，時(shí)間為10 h，溫度為15℃。

陳釀：澄清后獲得的酒液在5℃條件下進(jìn)行陳釀，后放置于陰涼通風(fēng)環(huán)境下進(jìn)行保藏。

1.4 GC-MS條件

量取葡萄酒4 mL置于15 mL裝有磁力攪拌器的頂空瓶中，加入1.0 g NaCl，加蓋密封，放入40℃水浴中平衡10 min，將老化好的固相微萃取器插在樣品瓶上，吸附40 min后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于230℃解吸3 min，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱為 DB-Wax（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為230℃；升溫程序：初始溫度40℃，保持5 min，以 6℃/min升至230℃，保持 6 min；載氣為氦氣，流速0.97 mL/min，不分流。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，離子源溫度為230℃，接口溫度為250℃，掃描范圍30.00～500.00 s/z。

1.5 感官評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)人員由10名食品專業(yè)的在校本科生組成。感官評(píng)價(jià)小組成員依據(jù)GB/T 16291.1-2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則第1部分：優(yōu)選評(píng)價(jià)員》和GB/T16291.2-2010《感官分析選拔、培訓(xùn)和管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則第2部分：專家評(píng)價(jià)員》進(jìn)行人員的選拔、培訓(xùn)與維護(hù)。對(duì)評(píng)價(jià)人員依據(jù)GB/T 29605-2013《感官分析食品感官質(zhì)量控制導(dǎo)則》要求進(jìn)行培訓(xùn)，分別對(duì)氣味和顏色兩個(gè)維度進(jìn)行訓(xùn)練；每個(gè)樣品重復(fù)評(píng)價(jià)3次。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

GC-MS試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Xcalibur軟件處理，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST譜庫(kù)和Wiley譜庫(kù)相匹配，只有當(dāng)正反匹配度均大于80（最大值為100）的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)。按峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。主成分、聚類分析及作圖均采用origin9.0完成。

表1 不同酒花葡萄酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Sensory evaluation standards of different hops wine

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同濃度酒花的玫瑰香葡萄酒的香氣成分GC-MS分析

利用 DB-Wax（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）毛細(xì)管柱色譜分離結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)，不同濃度酒花釀造的玫瑰香葡萄酒揮發(fā)性成分得到的5個(gè)樣品的離子流圖，見圖1。

圖1 添加不同濃度酒花釀造的玫瑰香葡萄酒的香氣成分的氣質(zhì)色譜總離子流程圖Fig.1 Total ion flow chart of aromatic components in rose-flavoured grape wine brewed with different concentrations of hops

由圖 1 可知，C00、E01、E02、E03、E04 分別分離出有效揮發(fā)性物質(zhì) 17、17、19、20、15 種，E04 的樣品揮發(fā)性成分相對(duì)較少；樣品出峰時(shí)間主要集中在20 min～30 min之間。

添加不同濃度的法格酒花釀造的玫瑰香葡萄酒中的風(fēng)味物質(zhì)成分表，見表2。

表2 添加不同濃度的法格酒花后玫瑰香葡萄酒中的風(fēng)味物質(zhì)成分表Table 2 Table of flavor components in rose-flavored grape wine with different concentrations of Fuggle hops

續(xù)表2 添加不同濃度的法格酒花后玫瑰香葡萄酒中的風(fēng)味物質(zhì)成分表Continue table 2 Table of flavor components in rose-flavored grape wine with different concentrations of Fuggle hops

由表2可知，GC-MS在添加了不同濃度酒花的玫瑰香葡萄酒中共鑒定出33種揮發(fā)性成分。在酒花濃度E03的樣品中檢測(cè)到揮發(fā)性物質(zhì)最多，為20種。其次是E02，為19種；空白樣和E01的樣品，均為17種；添加E04的樣品檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)最少，為15種。5個(gè)梯度樣品的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)百分含量分別為68.08%（空白），46.11%（E01），59.47%（E02），83.18%（E03）和 70%（E04）。

酯類物質(zhì)是葡萄酒中最重要的呈香物質(zhì)，其特征香味為水果和花香，它是在釀造過(guò)程中醇類和酸類的酯化反應(yīng)生成[23]。5種不同梯度的酒花玫瑰葡萄酒中酯類物質(zhì)相對(duì)百分含量由高到低分別是E03（21.95%），E02（16.44%），E04（11.94%），E01（7.22%），最低為C00（5.56%）。共有酯類物質(zhì)3種，乙酯類物質(zhì)是酯類中的主要物質(zhì)，乙酸酯是由細(xì)胞內(nèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的高級(jí)醇與乙酰輔酶A縮合形成[24]。檢測(cè)到的酯類物質(zhì)種類由多到少分別是 E03（11種），E02（10種），E04（7種），最低為E01和C00（6種）。添加酒花的葡萄酒中酯類物質(zhì)種類大多高于對(duì)照組。這說(shuō)明添加酒花后，葡萄酒中的酯類物質(zhì)無(wú)論是含量還是種類均有提高，這對(duì)葡萄酒的香味提升有促進(jìn)作用。

醇類物質(zhì)是酵母在發(fā)酵過(guò)程中代謝次級(jí)產(chǎn)物[25]，它是糖代謝氨基酸脫梭、脫氫產(chǎn)生，是酒中主要呈香物質(zhì)之一[26]。5種不同梯度的酒花玫瑰葡萄酒中醇類物質(zhì)相對(duì)百分含量由高到低分別是E03（58.75%），E04（58.02%），C00（57.28%），E02（42.52%），最低為E01（8.96%）。添加酒花的玫瑰葡萄酒醇類物質(zhì)并無(wú)明顯提高，而且添加量低于E03的樣品反而大幅降低，需要進(jìn)一步研究其原因。檢測(cè)到的醇類物質(zhì)種類由多到少分別是 E01和 E02（8種），E03和 C00（7種），E04和（6種）。說(shuō)明添加酒花對(duì)葡萄酒在發(fā)酵過(guò)程中醇類物質(zhì)種類并沒有明顯的影響。1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇是5種梯度酒花葡萄酒的共有成分，5種共有成分在酒花添加量為E03，E04和C00（空白）中較高，在添加量E02較低，在添加量為E01時(shí)最低。

酸類物質(zhì)是葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的副產(chǎn)物[27]，少部分來(lái)源于葡萄自身代謝的其他化合物[28]。酸類物質(zhì)的含量對(duì)葡萄酒口感有重要影響，過(guò)多或者過(guò)少都會(huì)造成不良影響。5種不同梯度的酒花葡萄酒中僅E01的樣品中檢出一種含量很高的酸類物質(zhì)–乳酸，而其他樣品均未檢出，需要進(jìn)一步研究其原因。

其他類物質(zhì)共檢出5種，且5種不同梯度的酒花葡萄酒均無(wú)共有成分。醛類物質(zhì)2種，酮、醚、烯類物質(zhì)各一種。

分析5個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組與其他樣品的差異主要體現(xiàn)在酯類物質(zhì)。而酯類物質(zhì)是葡萄酒非常重要的呈香物質(zhì)。因此可以推測(cè)，添加法格酒花會(huì)促進(jìn)葡萄酒在陳釀過(guò)程中呈香物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.2 添加不同梯度酒花玫瑰葡萄酒揮發(fā)性的主成分分析

為了更加直觀反應(yīng)5種不同梯度的酒花對(duì)玫瑰葡萄酒香味物質(zhì)的影響，對(duì)檢出的各揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3、圖2。

表3 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic value and contribution rate of principal components

圖2 添加不同濃度酒花玫瑰葡萄酒揮發(fā)性成分主成分分析載荷圖Fig.2 The PCA loading diagram of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

由表3可知，2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為98.29%，完全能夠反應(yīng)樣品的主要信息。王瓊等[29]認(rèn)為前兩個(gè)主成分超過(guò)85%即可反應(yīng)樣品的主要信息。

圖2a是添加不同梯度酒花玫瑰葡萄酒揮發(fā)性成分的主成分載荷圖，圖2b是重疊部分放大圖。

圖中各個(gè)揮發(fā)性成分在二維圖中的位置代表了其對(duì)主成分的貢獻(xiàn)。越靠近X軸正向表示對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)呈正相關(guān)，越靠近X軸負(fù)向表示對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)呈負(fù)相關(guān)。靠近Y軸表示的意義與X軸相似。圖中，A4（丙酸丁酯）、A5（丙酸異戊酯）、A10（正己酸乙酯）、15（癸酸乙酯）、A16（醋酸乙烯酯）、A18（1-戊醇）與PC1呈正相關(guān)。A2（碳酸甲乙酯）、A3（丙酸正丙酯）、A6（丁酸乙酯）、A7（2-甲基丁酸乙酯）、A8（乙酸異戊酯）、A9（醋酸乙烯酯）、A11（丁二酸二乙酯）、A12（苯甲酸乙酯）、A13（辛酸乙酯）、A14（乙酸苯乙酯）、A19（（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇）、A20（正己醇）、22（芳樟醇）、A23（苯乙醇）、A24（α-松油醇）、A25（香茅醇）、A26（橙花醇）、A27（2，3-己二醇）、A28（L-乳酸）、A29（4-羥基-2-丁酮）、A30（二乙二醇丁醚）、A31（苯甲醛）與PC1呈負(fù)相關(guān)。A21（正庚醇）與PC2呈正相關(guān)。A1（乙酸戊酯）、A17（異丁醇）、A32（丙烯醛）與PC2呈負(fù)相關(guān)方。

圖3是添加不同酒花玫瑰葡萄酒揮發(fā)性化合物種類主成分圖。

圖3 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒揮發(fā)性化合物種類含量主成分分析Fig.3 The PCA of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

PC1和PC2分別為58.44%和32.72%，累積貢獻(xiàn)率為91.16%，能夠反應(yīng)樣品的主要風(fēng)味輪廓。圖中可以看出E03與E04、E02比較相似，它們與C00有一定相似度，與E01差異較大。張曉敏等[30]認(rèn)為PC1越大，說(shuō)明PC1的貢獻(xiàn)越大，反映在二維圖中，兩個(gè)樣品即使在橫坐標(biāo)（X軸）的距離很小，其差異也很大；而兩個(gè)樣品在二維圖中即使在縱坐標(biāo)（Y軸）上距離很大，其差異也很小。圖中無(wú)法判斷E03與E04、E02、C00之間的兩兩相似度，需要進(jìn)一步研究。

2.3 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒揮發(fā)性化合物種類含量聚類分析

圖4是不同酒花的玫瑰葡萄酒揮發(fā)性化合物種類含量聚類分析結(jié)果。

圖4 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒揮發(fā)性化合物種類含量聚類分析Fig.4 The cluster analysis of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

圖4中C00和E04在8.927 04處聚類，說(shuō)明其最為相似。E03與C00和E04在13.604 28處聚類，說(shuō)明這3個(gè)樣相似度高。E02與E03、C00、E04在17.536 1處聚類，說(shuō)明這4個(gè)樣品有一定相似度，且明確了4個(gè)樣品兩兩之間的相似度，這是圖3主成分分析沒能解決的問(wèn)題。聚類分析對(duì)于樣品之間的相似度較主成分分析能夠更加清晰。5個(gè)樣品在54.972 94處聚成大類，這能夠說(shuō)明樣品E01與其他4個(gè)樣品差異明顯。

2.4 感官分析

圖5是添加不同酒花梯度的玫瑰葡萄酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖5 添加不同酒花梯度的玫瑰葡萄酒感官評(píng)價(jià)Fig.5 Sensory evaluation of rose-flavored grape wine with different hop gradients

圖中，E03樣品的酒香和香氣豐滿程度較C00和其他樣品高，這說(shuō)明添加E03號(hào)樣品在氣味上要比C00和其他劑量的樣品好，這可能與產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)。氣味得分最低的是E01。E02號(hào)樣品是色澤得分最高的樣品，得分最低是E04號(hào)樣品。這說(shuō)明酒花的添加量為E02時(shí)，釀造的葡萄酒色澤最佳，而添加量E04時(shí)色澤較差，這可能與酒花濃度有關(guān)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)將釀造啤酒的酒花引入到葡萄酒釀造中，通過(guò)GC-MS分析不同酒花添加量的葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)分析不同酒花添加量對(duì)香味和色澤的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：GC-MS共檢測(cè)到33種揮發(fā)物質(zhì)，其中酯類16種，占總比的48.48%，共有酯類物質(zhì)3種（乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯）；醇類11種，占總比的33.33%，共有醇類物質(zhì)5種（1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇），且E03號(hào)樣品檢測(cè)到的共有物質(zhì)含量最高；酸類物質(zhì)1種，占總比的3.03%；其他化合物5種，占總比的15.15%。主成分和聚類分析表明C00和E04最為相似，E03與C00和E04相似度高，E02與 E03、C00、E04有一定相似度，E01與其他4個(gè)樣品差異較大。感官分析表明E03的風(fēng)味最好，E02的色澤最佳。當(dāng)添加到玫瑰葡萄酒釀造中的酒花濃度達(dá)到一定劑量時(shí)，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和色澤有積極的作用，反之則可能是消極作用。本試驗(yàn)為研發(fā)新型葡萄酒提供理論依據(jù)，為推動(dòng)我國(guó)葡萄酒行業(yè)的發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。