不同脫苦方法對玉米活性肽苦味脫除效果的研究

戰(zhàn)旭梅，劉萍，祁興普，左成俊

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

隨著人民生活水平的不斷提高，消費者對食品營養(yǎng)與身體健康關(guān)系的認(rèn)識更加深入，對食品營養(yǎng)的要求也逐漸提高。玉米活性肽具有天然、易被人體消化吸收、抗氧化等優(yōu)良特性，符合消費者對健康食品的基本要求[1-3]。

玉米活性肽是玉米蛋白的水解產(chǎn)物，利用酶法對玉米蛋白進行水解生產(chǎn)的玉米肽具有高效性、安全性等特點[2]，另外，還可以利用其抗疲勞、抗氧化、促進乙醇代謝等活性[3-5]，開發(fā)成運動飲料、醒酒飲料等功能性食品。

但是，玉米蛋白水解后變?yōu)橛衩纂臅尸F(xiàn)出原來沒有的苦味，苦味形成的主要原因是疏水性氨基酸殘基的暴露。一般天然蛋白質(zhì)的疏水基團常藏于分子內(nèi)部，不會呈苦味，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成小分子肽時，疏水性氨基酸殘基暴露，與味蕾上的受體蛋白緊密接觸，產(chǎn)生苦味[6]，因此，限制了玉米活性肽在食品中的應(yīng)用。

本文分別采用風(fēng)味酶酶切法和活性炭吸附法對玉米活性肽脫苦進行研究。比較了2種方法對玉米活性肽脫苦效果的影響，旨在探求一種脫苦效果好的方法，對玉米活性肽在食品中的應(yīng)用推廣提供實際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉：河北興隆植物油有限公司，粗蛋白含量為60.29%；堿性內(nèi)切蛋白酶（2.4AU/g）、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（1 000 LAPU/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PRIMOR高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技公司；LABCONCO-6L冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 濃縮玉米蛋白的制備

玉米蛋白粉→按料液比1∶15（g/mL）加入堿醇液[由0.1 mol/L NaOH與95%乙醇按45∶55（體積比）配制]→于55℃水浴中回流浸提→過濾→浸提液按1∶1（體積比）加水→調(diào)pH值至6.4→按5∶1（體積比）加2%NaCl溶液鹽析→3 000 r/min離心10 min→取沉淀部分于低于60℃烘干→研細(xì)，過80目篩→玉米濃縮蛋白粉，備用[7]。

1.3.2 玉米粗肽（crude cornpeptide，CCP）的制備

玉米濃縮蛋白粉適量→加水[料液按1∶10（g/mL）配制]→95℃～100℃預(yù)變性10 min→冷卻→調(diào)pH值至8.0，溫度至55℃→加入0.5%的堿性內(nèi)切蛋白酶酶解4 h→沸水浴10 min使酶滅活→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→備用。

1.3.3 風(fēng)味酶法脫苦試驗方法

玉米濃縮蛋白粉→加水 [料液按1∶10配制（g/mL）]→95℃～100℃預(yù)變性10 min→冷卻→調(diào)pH值至6.5，溫度至50℃→加入風(fēng)味蛋白酶酶解4 h→沸水浴10 min滅酶活→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→對樣品進行苦味評價

1.3.4 風(fēng)味蛋白酶脫苦試驗設(shè)計優(yōu)化

以玉米活性肽苦味值的作為評價指標(biāo)，分別討論pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶底比 E/S（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解時間（1、2、3、4、5、6 h）的脫苦效果?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果選取3個適宜水平進行正交試驗，以苦味值為指標(biāo)，確定風(fēng)味酶脫苦的最佳條件。

1.3.5 活性炭脫苦試驗方法

取一定量的玉米粗肽（CCP），按料液比 1∶10（g/mL）加水配成溶液，加入活性炭，調(diào)節(jié)pH值、溫度，連續(xù)攪拌以使活性炭不沉淀為宜，攪拌2 h后過濾除去活性炭，真空濃縮，冷凍干燥，成品評定苦味?；钚蕴吭谑褂们?，先置于120℃的烘箱中活化4 h以上。

1.3.6 活性炭脫苦試驗設(shè)計優(yōu)化

以玉米活性肽苦味值作為評價指標(biāo)，分別討論pH值（1、2、3、4、5、6、7、8）、溫度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）、活性炭添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）的脫苦效果。基于單因素試驗結(jié)果選取3個適宜水平進行正交試驗，以玉米活性肽苦味值為指標(biāo)，確定活性炭脫苦的最佳條件。

1.3.7 玉米活性肽苦味的評價方法

采用感官評定的方法，稱取1 g玉米粗肽（CCP），溶于100 mL的純水中，制備成玉米肽（CCP）溶液提供給20名品嘗者（男、女各10名，20歲～30歲，均為不吸煙者），按照GB/T 12312-2012《感官分析味覺敏感度的測定方法》的方法，將結(jié)晶咖啡因（一水合物，分子量212.12）配成不同的濃度，見表1，根據(jù)此評分標(biāo)準(zhǔn)，品嘗CCP溶液，并與標(biāo)準(zhǔn)比較評定苦味值，最后取平均值作為玉米活性肽最終苦味值。

表1 感官評定苦味標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Bitter standard by sensory evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味蛋白酶酶解對玉米活性肽脫苦效果的影響

玉米蛋白水解為玉米粗肽時，疏水性氨基酸殘基暴露出來，使玉米肽呈現(xiàn)苦味，疏水性氨基酸主要位于肽的末端，如果切除此類疏水性氨基酸，肽的苦味將會明顯下降，這是采用酶切法脫除蛋白水解物中苦味的基礎(chǔ)[8]。風(fēng)味蛋白酶酶主要為外切蛋白酶，能夠催化水解肽鏈末端的疏水性氨基酸，從而降低酶解產(chǎn)物的苦味強度[9]。

2.1.1 酶解pH值對玉米活性肽苦味值的影響

在酶底比E/S為1.5%，酶解時間為4 h的條件下，試驗pH值對苦味值的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值對玉米肽苦味值的影響Fig.1 Effect of pH value on corn peptide bitterness

由圖1可知，在pH值小于6.5時，苦味值隨溶液pH值升高而逐漸下降，當(dāng)pH值達到6.5時，苦味值最小，當(dāng)pH值大于6.5后，隨著pH值的升高，苦味值緩慢上升，苦味脫除效果減弱。因為pH值的變化，改變了風(fēng)味蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使其活性降低，水解能力變?nèi)酰源_定風(fēng)味蛋白酶脫苦的最適pH值為6.5。

2.1.2 酶底比（E/S）對玉米活性肽苦味值的影響

在pH值為6.5，酶解時間為4 h的條件下，試驗酶底比（E/S）對苦味值的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶底比（E/S）對玉米肽苦味值的影響Fig.2 Effect of the ratio of enzyme to substrate（E/S）on corn peptide bitterness

隨著酶底比（E/S）的增加，風(fēng)味蛋白酶的水解能力變強，玉米活性肽苦味下降，到1.5%后繼續(xù)增加酶底比（E/S），玉米肽的苦味值變化緩慢，從經(jīng)濟方面考慮，確定最酶底比（E/S）為1.5%。

2.1.3 酶解時間對玉米活性肽苦味值的影響

在酶底比（E/S）為1.5%，pH值為6.5的條件下，試驗酶解時間對玉米活性肽苦味值的影響。結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，隨著酶解時間的增加，玉米肽的苦味值迅速下降，當(dāng)酶解時間達到4 h后，再繼續(xù)延長酶解時間，苦味值基本不變，說明玉米蛋白基本水解完全，所以確定最適的酶解時間為4 h。

2.1.4 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以玉米肽的苦味值為指標(biāo)，進行三因素三水平正交試驗，因素水平表見表2，分析結(jié)果見表3。

圖3 酶解時間對玉米肽苦味值的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on corn peptide bitterness

表2 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味正交試驗因素水平表Table 2 Level table of orthogonal experimental factors for corn peptide bitterness removal by flavor protease enzymatic hydrolysis

由表3可知，風(fēng)味蛋白酶水解玉米蛋白對所產(chǎn)生玉米肽苦味值影響因素的主次順序為：B＞C＞A，即酶底比（E/S）＞酶解時間＞pH值，最佳的試驗方案為A1B2C1，即 pH 6.0，酶底比（E/S）1.5%，酶解時間 3 h。

驗證試驗：根據(jù)正交試驗優(yōu)化的條件，進行驗證試驗，在次條件下進行3次平行試驗，得到玉米活性肽的苦味值平均值為1.07，基本嘗不出苦味。

2.2 活性炭吸附對玉米活性肽脫苦效果的影響

活性炭是一種多孔性含碳物質(zhì)，具有很強的吸附能力，在食品工業(yè)等方面應(yīng)用廣泛。

2.2.1 溶液pH值對玉米活性肽苦味值的影響

在溫度55℃，活性炭添加量3.5%的條件下，試驗溶液的pH值對玉米活性肽苦味值的影響。結(jié)果如圖4所示。

表3 風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment of corn peptide bitterness removal by flavor protease enzymatic hydrolysis

圖4 溶液pH值對玉米肽苦味值的影響Fig.4 Effect of pH value on corn peptide bitterness

由圖4可知，在pH值小于5.0時，玉米肽的苦味值隨溶液pH值升高而降低，當(dāng)pH值達到5.0時苦味值達到最小值，然后pH值增加，苦味脫除效果減弱。是因為活性炭在酸性條件下的吸附能力比在堿性條件下的吸附能力大，因此，確定溶液pH值5.0時，活性炭的脫苦效果最好。

2.2.2 活性炭用量對玉米活性肽苦味值的影響

在溫度55℃，溶液pH 5.0的條件下，試驗活性炭用量對玉米肽苦味值的影響。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，玉米肽的苦味值與活性炭用量成反比?；钚蕴坑昧吭黾樱衩纂牡目辔吨抵饾u降低，當(dāng)活性炭用量為3.5%時，玉米肽溶液的苦味值已降低為1，基本嘗不出苦味。繼續(xù)增加活性炭的用量，苦味值基本不變，從降低成本的角度出發(fā)，選擇活性炭用量為3.5%。

圖5 活性炭用量對玉米肽苦味值的影響Fig.5 Effect of activated carbon dosage on corn peptide bitterness

2.2.3 溫度對玉米活性肽苦味值的影響

在溶液pH 5.0，活性炭用量為3.5%的條件下，試驗溫度對玉米活性肽苦味值的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對玉米活性肽苦味值的影響Fig.6 Effect of temperature on corn peptide bitterness

由圖6可以看出，在30℃～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度增加，苦味值逐漸下降，到達55℃以后再增加溫度就基本上沒什么效果了，反而如果溫度太高，會吸附玉米肽，造成玉米肽的損失。因此，選擇活性炭脫苦的最佳溫度為55℃。

2.2.4 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以玉米肽的苦味值為指標(biāo)，進行三因素三水平正交試驗，因素水平表見表4，分析結(jié)果見表5。

由表5可知，活性炭吸附對玉米肽苦味值影響的主次順序為：B＞C＞A，即活性炭添加量＞溫度＞pH值，最佳的試驗方案為A2B1C3，即活性炭添加量3.0%，溫度 60℃，pH 5.0。

表4 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗因素水平表Table 4 Orthogonal experimental factor level table of corn peptide bitter removal by activated carbon adsorption

驗證試驗：根據(jù)正交試驗優(yōu)化的條件，進行驗證試驗，在次條件下進行3次平行試驗，得到玉米活性肽的苦味值平均值為1.27，基本嘗不出苦味。

表5 活性炭吸附去除玉米肽苦味的正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of corn peptide bitterness removal by activated carbon adsorption

3 結(jié)論

本試驗研究了風(fēng)味蛋白酶和活性炭對玉米活性肽脫苦效果的研究，以得到玉米活性肽的苦味值為指標(biāo)，試驗得到最佳條件是：風(fēng)味蛋白酶在pH6.0，酶底比（E/S）1.5%，酶解時間3 h，得到玉米活性肽苦味值為1.07，已基本嘗不出苦味；活性炭在玉米活性肽溶液pH 5.0，溫度60℃，活性炭添加量3.0%，吸附2 h，得到得到玉米活性肽苦味值為1.27，與風(fēng)味蛋白酶酶解去除玉米肽苦味此效果相差不顯著，但是，活性炭具有良好的吸附功能，除了可以吸附玉米活性肽的苦味，難免會造成營養(yǎng)的損失，因此，根據(jù)研究、生產(chǎn)的實際情況，選擇合適的脫苦方法。