基于拉曼光譜快速分析感冒藥中的有效成分

劉金夢(mèng)，劉 柳，宮 博，粟 暉，姚志湘

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

0 引言

對(duì)乙酰氨基酚是感冒藥酚麻美敏片中的主要成分，在臨床上用于各類感冒的治療，適用于各個(gè)年齡的人群，但如果服用過(guò)量，便會(huì)引起嚴(yán)重的肝損傷和肝衰竭等問題.在現(xiàn)行的2015年版《中國(guó)藥典（第二部）》采用色譜法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚片劑、咀嚼片劑、栓劑和顆粒劑等[1].參考相關(guān)文獻(xiàn)可知，通常采用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法[2-3]、循環(huán)伏安法[4]、LC-MS聯(lián)用技術(shù)[5]、電化學(xué)法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]等.這些傳統(tǒng)的方法具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于大批量樣本的分析效率低，操作強(qiáng)度大，流動(dòng)相等試劑損耗大，分析成本較高，不宜實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣本的快速檢測(cè).因此，建立快速、準(zhǔn)確的光譜定量方法對(duì)于藥品質(zhì)量控制具有積極作用和創(chuàng)新意義.

姚志湘等[8]利用向量方向的確定性，將信號(hào)的強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成向量空間角，通過(guò)熒光褪色差分法，實(shí)現(xiàn)拉曼光譜背景矯正[9].并提出一種基于角度轉(zhuǎn)換的近似線性定量方法，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)向量角度轉(zhuǎn)換和紅外光譜對(duì)蔗糖-6-乙酸酯合成過(guò)程進(jìn)行分析[10]以及中紅外光譜結(jié)合向量夾角直接定量三氯蔗糖[11].本文通過(guò)角度轉(zhuǎn)換結(jié)合拉曼光譜技術(shù)，建立對(duì)乙酰氨基酚含量和拉曼光譜的關(guān)聯(lián)模型，快速測(cè)定感冒藥片中的對(duì)乙酰氨基酚含量.該方法無(wú)需大數(shù)據(jù)建模，不依賴光譜特征響應(yīng)，為多組分體系的快速分析檢測(cè)提供了參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；拉曼光譜儀（ExR610，西派特（北京）有限公司）；分析天平（AR124CN奧豪斯儀器有限公司）；酚麻美敏片（藥店市售）；對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（99.0%，AR，阿拉丁有限公司）；淀粉（AR）.

1.2 系列樣本制備

取市售酚麻美敏片15粒，研磨均勻后稱取11份，編號(hào)為A1—A11；依照表1，向11份待測(cè)藥片粉末中，分別添加一定量的對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品或淀粉，混合均勻，配制成不同含量的對(duì)乙酰氨基酚建模樣本.

另取市售酚麻美敏片5粒，研磨均勻后，分成5份，記為S1—S5.

表1 建模樣本各物質(zhì)添加量及含量表Tab.1 Modeling sample for each substance addition amount and content table

1.3 樣本拉曼光譜的采集

分別通過(guò)單點(diǎn)單次、單點(diǎn)3次、3點(diǎn)3次采集A1—A11建模樣本、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品M1以及5份待測(cè)藥品S1—S5的拉曼光譜數(shù)據(jù)，光譜采集參數(shù)為光譜積分時(shí)間6 000 ms，平均次數(shù)1，平滑點(diǎn)數(shù)0，中心波長(zhǎng)532 nm；功率等級(jí)9.

1.4 分析關(guān)聯(lián)方程建立和驗(yàn)證

1）將A1—A11和M1光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB2018b計(jì)算平臺(tái)；根據(jù)對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品的純光譜，選擇合適的分析波數(shù)區(qū)間，對(duì)該波數(shù)區(qū)間的光譜進(jìn)行求導(dǎo)降噪.

2）在選擇的波數(shù)區(qū)間內(nèi)，選取合適的移動(dòng)窗口寬度.

3）取其中A1、A3、A5、A7、A9、A11，將移動(dòng)窗口從最小波數(shù)開始將光譜左端向右端移動(dòng)，依次計(jì)算得到M1與A1、A3、A5、A7、A9、A11的系列夾角值EEi，得到對(duì)乙酰氨基酚含量和拉曼光譜轉(zhuǎn)換后角度值的關(guān)聯(lián)方程.

4）同理計(jì)算得到A2、A4、A6、A10的夾角值，分別代入關(guān)聯(lián)方程，得到樣本中對(duì)乙酰氨基酚含量預(yù)測(cè)值，與真實(shí)值進(jìn)行比較，通過(guò)誤差分析驗(yàn)證所建立的關(guān)聯(lián)方程.

1.5 待測(cè)樣本含量分析

取市售酚麻美敏片5片，研磨均勻，記為S1—S5，通過(guò)1.4數(shù)據(jù)處理流程，得到待測(cè)樣本與純目標(biāo)組分M1的夾角值YEi，代入關(guān)聯(lián)方程，得到待測(cè)樣本S1—S5中對(duì)乙酰氨基酚的含量，并采用高效液相色譜儀對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行比較分析.

其中液相色譜條件為：色譜柱為C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫為25℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（磷酸鹽緩沖溶液）=10∶90（磷酸鹽緩沖溶液：pH3.5，5.175 g磷酸二氫鉀，116 μL磷酸，200 μL的三乙胺，超純水定容至1 000 mL）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm和240 nm.

1.6 方法學(xué)檢驗(yàn)

1）回收率試驗(yàn)：選擇已知含量的感冒藥樣本，分別加入不同含量的對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品，等質(zhì)量混合均勻，得到3份加標(biāo)樣本，采集拉曼光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)本方法計(jì)算得到加標(biāo)樣本中的對(duì)乙酰氨基酚含量，并計(jì)算回收率.

2）精密度試驗(yàn)：選擇A1、A9樣本，分別平行采集拉曼光譜6次，計(jì)算得到待測(cè)藥品拉曼光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)本方法得到待測(cè)樣本與對(duì)照品對(duì)乙酰氨基酚拉曼光譜的夾角方差值，計(jì)算待測(cè)樣本中對(duì)乙酰氨基酚的含量.

3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)待測(cè)酚麻美敏片，按1.2配制方法平行配制6份，記為B1—B6.通過(guò)采集樣本的拉曼光譜數(shù)據(jù)后得到與對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品的夾角值，計(jì)算得到待測(cè)樣本中對(duì)乙酰氨基酚的含量，考察方法的重復(fù)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 分析模型建立

圖1、圖2為對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品和酚麻美敏片樣本的拉曼光譜圖，圖中A為沒有處理的原始譜圖，B為處理后的拉曼光譜圖.

圖1 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品的拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectroscopy of standard acetaminophen

圖2 酚麻美敏片樣本拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectroscopy of cold medicine

由圖1、圖2可以看出：沒有處理的A樣本光譜重疊嚴(yán)重，同時(shí)存在熒光干擾和基線漂移，易造成分析誤差.因此，通過(guò)對(duì)分析樣本進(jìn)行基線校正和降噪處理，減小熒光效應(yīng)和儀器噪聲造成的影響.得到經(jīng)過(guò)基線校正和降噪處理后的拉曼光譜圖B.

根據(jù)系列樣本拉曼光譜特征峰響應(yīng)選擇400～3 400 cm-1作為分析波數(shù)區(qū)間；設(shè)置此區(qū)間波長(zhǎng)的1/11寬度為移動(dòng)窗口，從最小波數(shù)點(diǎn)200 cm-1開始，計(jì)算樣本光譜與對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品光譜的系列夾角值EEi，建立樣本中對(duì)乙酰氨基酚含量與EEi的關(guān)聯(lián)曲線.依次對(duì)單點(diǎn)單次、單點(diǎn)3次、3點(diǎn)3次采集的樣本拉曼光譜進(jìn)行分析，3點(diǎn)3次采集方式結(jié)果最好，關(guān)聯(lián)方程為y=-0.013 1x+1.626 5，r=0.998 0.

同理，計(jì)算其余樣本A2、A4、A6、A10的夾角值，帶入關(guān)聯(lián)方程中，得到預(yù)測(cè)含量及誤差分析，結(jié)果見表2.

由表2可以看出，測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)含量相比，相對(duì)誤差在0.4%～1.9%，預(yù)測(cè)結(jié)果較好，說(shuō)明拉曼光譜結(jié)合角度轉(zhuǎn)換的方法建立的關(guān)聯(lián)方程準(zhǔn)確性良好，適用于感冒藥中有效成分含量的快速分析.

表2 驗(yàn)證樣本中對(duì)乙酰氨基酚的含量預(yù)測(cè)值與誤差分析Tab.2 Predicted content and error analysis of acetaminophen%

2.2 待測(cè)藥片含量分析

通過(guò)將S1—S5待測(cè)樣本的角度值代入2.1所得的關(guān)聯(lián)方程中，得到藥片中對(duì)乙酰氨基酚的實(shí)際含量，結(jié)果見表3.

由表3可知，本方法測(cè)定感冒藥中的對(duì)乙酰氨基酚與高效液相色譜法結(jié)果接近，誤差較小，計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確，本方法可以很好地實(shí)現(xiàn)感冒藥中對(duì)乙酰氨基酚含量的快速分析.

2.3 樣品精密度的測(cè)定

通過(guò)本方法得到待測(cè)藥品光譜與對(duì)照品拉曼光譜的夾角方差值，計(jì)算出樣本A1、A9中對(duì)乙酰氨基酚的含量，精密度結(jié)果如表4.

由表4結(jié)果可知，此方法檢測(cè)感冒藥中的對(duì)乙酰氨基酚，對(duì)乙酰氨基酚的RSD小于3.1%，精密性良好，可以實(shí)現(xiàn)樣品中待測(cè)組分的快速分析與檢測(cè).

2.4 重復(fù)性測(cè)定

通過(guò)本方法測(cè)定得到待測(cè)樣中對(duì)乙酰氨基酚的含量，重復(fù)性結(jié)果如表5.

由表5結(jié)果可知，待測(cè)樣品中對(duì)乙酰氨基酚的RSD為1.1%，結(jié)果較好.說(shuō)明拉曼光譜結(jié)合角度轉(zhuǎn)換的方法檢測(cè)感冒藥中的對(duì)乙酰氨基酚重復(fù)性良好，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)組分的分析與檢測(cè).

2.5 回收率測(cè)定

在已知對(duì)乙酰氨基酚含量為66.8%的藥品中，加入不同含量的對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品，等質(zhì)量混合均勻，測(cè)定得加標(biāo)樣品中對(duì)乙酰氨基酚的含量并計(jì)算回收率，結(jié)果如表6.

由表6結(jié)果可知，待測(cè)樣本中對(duì)乙酰氨基酚的回收率為97.0%～106.3%.說(shuō)明拉曼光譜結(jié)合角度轉(zhuǎn)換的方法檢測(cè)感冒藥中的對(duì)乙酰氨基酚回收率高，結(jié)果較好，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)組分的快速分析與檢測(cè).

表3 待測(cè)樣品中對(duì)乙酰氨基酚的含量Tab.3 The content of acetaminophen in the sample to be tested %

表4 待測(cè)樣品中對(duì)乙酰氨基酚的含量計(jì)算Tab.4 Calculation of acetaminophen content in the sample to be tested %

表5 樣本中對(duì)乙酰氨基酚的含量計(jì)算Tab.5 Calculation of acetaminophen content in the sample %

表6 樣本中對(duì)乙酰氨基酚的含量計(jì)算Tab.6 Calculation of acetaminophen content in the sample %

3 結(jié)論

本文使用拉曼光譜儀采集感冒藥中有效成分的光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)角度轉(zhuǎn)換法建立含量-角度值模型，模型的線性方程相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.998 0，準(zhǔn)確度較高.測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)含量相比，誤差較小，預(yù)測(cè)結(jié)果較好.

建立的分析方法無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜前處理，樣品測(cè)量時(shí)間可小于30 s，操作簡(jiǎn)單，適合于同類大批量樣品的快速分析測(cè)定.拉曼光譜法在藥物分析的研究中提供了一種新的參考方法，對(duì)利用光譜分析快速分析多組分樣品具有重要的參考價(jià)值.