牛乳鐵蛋白活性多肽LfcinB在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)、純化及生物活性分析

劉珂杭,宗西翠,張慧丹,完顏楊珂,陳玉清

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇 南京 210023) (2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院,醫(yī)學(xué)院西醫(yī)基礎(chǔ)教研室,江蘇 泰州 225300)

抗菌肽是廣泛存在于生物界的先天免疫小肽,具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[1-3]. Bovine lactoferricin(LfcinB)是一種陽(yáng)離子抗菌肽,它是牛乳中的乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解后,從N端釋放的由25個(gè)氨基酸殘基組成的生物活性多肽[4]. LfcinB的氨基酸序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF,結(jié)構(gòu)中的2個(gè)半胱氨酸通過(guò)形成分子內(nèi)二硫鍵使LfcinB呈現(xiàn)不完全的桶狀結(jié)構(gòu). 研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵在LfcinB生物活性中的作用不大,被破壞后抗菌活性并不減弱[5].

LfcinB具有多種生物學(xué)功能. 不同細(xì)菌對(duì)LfcinB的敏感性有所不同;LfcinB濃度在0.1 μg/mL時(shí),對(duì)敏感細(xì)菌的生長(zhǎng)就有明顯的抑制作用[4]. LfcinB和某些抗生素之間存在協(xié)同作用,鹽酸二甲胺四環(huán)素和LfcinB聯(lián)合使用能夠顯著提高對(duì)抗生素敏感的耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用[6]. 另外,Yan等發(fā)現(xiàn)LfcinB對(duì)人類關(guān)節(jié)軟骨和滑膜產(chǎn)生有效的抗分解代謝和抗炎作用[7]. Mader等研究發(fā)現(xiàn)LfcinB對(duì)人類白血病細(xì)胞有細(xì)胞毒性,但對(duì)正常人類淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞沒有任何不良影響,LfcinB可以通過(guò)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)線粒體依賴的凋亡途徑殺死癌細(xì)胞[8].

抗菌肽分子量小、分子中含有堿性氨基酸使得對(duì)一些蛋白酶敏感,并且也存在表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性. 因此,為避免抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性,降低蛋白酶的水解作用以及方便純化和制備,通常采用大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)[9]. 目前已報(bào)道多種可成功用于抗菌肽的原核表達(dá)和純化的融合標(biāo)簽,包括GST、MBP、DAMP21、Trx等[10]. 泛素化相關(guān)小分子蛋白(SUMO)標(biāo)簽是一種已被用于大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng),與SUMO融合可以增強(qiáng)目的蛋白的可溶性表達(dá),切割SUMO標(biāo)簽的SUMO蛋白酶也具有高度的特異性和高效的切割效率,并且當(dāng)目標(biāo)蛋白直接融合到SUMO的C端時(shí),SUMO蛋白酶裂解后不會(huì)在目標(biāo)蛋白的N端留下多余的氨基酸殘基[11]. 鑒于SUMO標(biāo)簽的促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá)、保護(hù)融合的蛋白免受蛋白酶水解的作用、標(biāo)簽容易切除的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)廣泛應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的融合表達(dá). 抗菌肽分子量小,融合表達(dá)時(shí)通常產(chǎn)量很低,多基因串聯(lián)表達(dá)被認(rèn)為是提高小分子肽表達(dá)產(chǎn)量的有效方法[12]. 因此,本研究首次嘗試以SUMO作為L(zhǎng)fcinB融合標(biāo)簽,采取LfcinB基因串聯(lián)表達(dá)的策略,以期獲得較高得率且有生物學(xué)活性的LfcinB,為發(fā)展更有效的重組抗菌肽制備技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)、DH5α和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心;大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12由本實(shí)驗(yàn)室保藏. 表達(dá)載體pSUMO為本實(shí)驗(yàn)室保存;HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Taq酶和DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、T4 DNA Ligase均購(gòu)自TaKaRa生物公司;DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司;Ni2+chelating Sepharose Fast Flow購(gòu)自Pharmacia Biotech公司;鼠抗anti-6×His一抗,山羊抗鼠IgG(FITC)購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司;IPTG購(gòu)自Promega公司. Annexin V-FITC/PI購(gòu)自南京凱基生物公司.

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pSUMO-(LfcinB)n的構(gòu)建

根據(jù)抗菌肽LfcinB的核苷酸序列和載體pSUMO多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)合成pSUMO-F和pSUMO-R兩條引物. 兩引物中除了引入克隆位點(diǎn)(BamHⅠ和Hind Ⅲ)以外還引入了BamHⅠ的同尾酶BglⅡ以及羥氨的識(shí)別序列等位點(diǎn). 引物序列如下(紅色字體表示BamHⅠ酶切位點(diǎn),藍(lán)色字體表示Hind Ⅲ酶切位點(diǎn),黃色字體表示BglⅡ酶切位點(diǎn),劃線部分為羥胺切割位點(diǎn)):

pSUMO-F:5′ CGGGATCCAACGGCTTTAAATGCCGCCGCTGGCAGTGGC 3′,

該電子版多媒體雜志雖與傳統(tǒng)紙質(zhì)期刊一樣具有中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物號(hào)，即ISSN號(hào)和CN號(hào)，但由于載體不同，電子版多媒體雜志屬于“連續(xù)型電子期刊”，所以，在期刊查詢時(shí)，依次進(jìn)入“辦事服務(wù)”→“便民查詢”→“新聞出版機(jī)構(gòu)查詢”→“連續(xù)型電子期刊”中輸入一項(xiàng)或多項(xiàng)期刊對(duì)應(yīng)信息可以檢索到中國(guó)醫(yī)藥科技出版社電子版系列雜志。

pSUMO-R:5′ CCAAGCTTAGATCTGCCGTTGCCACTGCCAGCGGCGGCATTTAAA 3′.

以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的載體pET32a-LfcinB為模板合成含有LfcinB的核苷酸序列,BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pSUMO質(zhì)粒和LfcinB基因的PCR產(chǎn)物,經(jīng)T4 DNA ligase連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α. 轉(zhuǎn)化液涂布到氨芐抗性的LB平板上,37 ℃倒置培養(yǎng),待長(zhǎng)出單菌落. 提取單菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,獲得正確的重組質(zhì)粒pSUMO-LfcinB.

1.2.2 表達(dá)載體pSUMO-(LfcinB)2和表達(dá)載體pSUMO-(LfcinB)3的構(gòu)建

用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pSUMO-LfcinB,純化后回收酶切片段,16 ℃下用 T4 DNA Ligase連接上述雙酶切的載體和片段,連接液轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,37 ℃,12 h～16 h進(jìn)行倒置培養(yǎng)待其長(zhǎng)出單菌落. 提取單菌落的質(zhì)粒,獲得pSUMO-(LfcinB)2并測(cè)序鑒定. 進(jìn)一步將得到的pSUMO-(LfcinB)2用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分別雙酶切,回收雙酶切產(chǎn)物后經(jīng)T4 DNA Ligase連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α. 涂布固體LB平板上(50 μg/mL 卡那霉素)于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h～16 h,挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒,獲得pSUMO-(LfcinB)3,測(cè)序鑒定.

1.2.3 表達(dá)宿主菌的構(gòu)建

將以上序列鑒定正確的pSUMO-LfcinB、pSUMO-(LfcinB)2、pSUMO-(LfcinB)3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3),涂布固體LB平板上(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h～16 h,挑選單個(gè)克隆培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定,獲得重組表達(dá)菌E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)1、E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)2和E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)3.

1.2.4 SUMO-(LfcinB)n重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

重組蛋白質(zhì)量的計(jì)算方法:使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定各個(gè)拷貝菌株中上清蛋白的濃度,并利用Bandscan 5.0軟件對(duì)凝膠圖片中的電泳條帶進(jìn)行光密度分析,計(jì)算重組蛋白質(zhì)量.

1.2.5 LfcinB的純化

每50 μg SUMO-(LfcinB)n融合蛋白加入1 U SUMO酶,30 ℃反應(yīng)30 min. 再用1M羥氨切割2 h,切割產(chǎn)物用PBS緩沖液透析去除羥氨,再通過(guò)Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B層析分離純化,收集穿透峰對(duì)應(yīng)流出液,用PBS緩沖液進(jìn)行透析. 最后將樣品上樣于半制備分離柱Bechman C18,在 Agilent HPLC 1100層析儀上進(jìn)行反相分離,用含0.1%的三氟乙酸的15%～75%乙腈進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫峰樣品,透析后冷凍干燥保存. 保存的凍干樣品取少量溶解測(cè)濃度,并計(jì)算回收率.

重組蛋白純化回收率(%)=回收重組蛋白的質(zhì)量/切割融合蛋白質(zhì)量×100%.

1.2.6 Tricine-SDS-PAGE電泳

凍干樣品溶于無(wú)菌水后考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定濃度,然后取樣品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE,濃縮膠濃度 4%,夾層膠濃度 10%,分離膠濃度16.5%,按常規(guī)方法進(jìn)行.

1.2.7 抗細(xì)菌活性的測(cè)定

采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定重組LfcinB對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗菌活性. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌按1%加入瓊脂糖 LB 培養(yǎng),凝固后用滅菌槍頭打孔,在孔中加入待測(cè)樣品液,于37 ℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜,觀察抑菌活性.

1.2.8 抗腫瘤毒性檢測(cè)

1×106/mL鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞1 mL培養(yǎng)于6孔板,分別用不同濃度重組LfcinB肽孵育16 h;收集細(xì)胞加入凋亡檢測(cè)染色液 Annexin V-FITC和PI,室溫避光反應(yīng)15 min,分別進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm.

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),獲得至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)并表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)(S.D.). 使用單因素方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)以確定不同組之間的顯著差異.P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 pSUMO-(LfcinB)n表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為提高抗菌肽的表達(dá)產(chǎn)量,通常采用串聯(lián)多聚體形式來(lái)代替單體形式進(jìn)行抗菌肽的融合表達(dá)[9,13]. pSUMO是本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一個(gè)帶有SUMO標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒,具有BamHⅠ、XbaⅠ、BglⅡ等多克隆酶切位點(diǎn). 將擴(kuò)增得到的LfcinB基因片段和pSUMO經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連接獲得pSUMO-LfcinB. 將得到的質(zhì)粒pSUMO-LfcinB利用同尾酶技術(shù),對(duì)pSUMO-LfcinB分別用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ兩個(gè)雙酶切體系進(jìn)行切割,然后對(duì)兩個(gè)體系分別回收大、小片段,用T4 DNA Ligase連接大小片段后即可得到雙拷貝表達(dá)載體pSUMO-(LfcinB)2. 用同尾酶技術(shù)進(jìn)一步對(duì)pSUMO-(LfcinB)2進(jìn)行切割和連接,得到3個(gè)串聯(lián)拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒pSUMO-(LfcinB)3. 構(gòu)建的大體流程如圖1所示. 同尾酶是指具切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的粘性末端的一類限制性內(nèi)切酶,利用同尾酶技術(shù)可以構(gòu)建多拷貝串聯(lián)基因重組質(zhì)粒[14]. 本研究中利用同尾酶BamHⅠ和BglⅡ酶切連接后形成新序列GGATCT,并結(jié)合非同尾酶XhoⅠ使得LfcinB基因片段能夠定向連續(xù)插入載體,成功構(gòu)建出pSUMO-(LfcinB)n(n=2,3),經(jīng)測(cè)定序列構(gòu)建正確.

2.2 SUMO-(LfcinB)n重組蛋白的表達(dá)

pSUMO-(LfcinB)n轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌E.coliBL21(DE3)細(xì)胞,得到重組菌株E.coliBL21/pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 重組菌株加入IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間,測(cè)定SUMO-(LfcinB)n表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性,結(jié)果如圖2a所示. 各重組菌株的生長(zhǎng)速度比較如下:E.coli/pSUMO-(LfcinB)3

由于抗菌肽自身的抗菌性,通常采用融合表達(dá)策略以降低潛在的宿主細(xì)胞毒性. 然而,并非所有的融合標(biāo)簽都能有效避免宿主細(xì)胞毒性,例如GST標(biāo)簽并不能有效避免宿主細(xì)胞毒性[15]. 本研究發(fā)現(xiàn)SUMO標(biāo)簽融合能在一定程度上避免(LfcinB)n宿主細(xì)胞毒性,并且影響的程度與串聯(lián)拷貝數(shù)有關(guān). SUMO-(LfcinB)3表達(dá)的宿主細(xì)胞毒性最大,SUMO-(LfcinB)2表達(dá)的宿主毒性最低,推測(cè)原因可能在于不同拷貝數(shù)串聯(lián)(LfcinB)n與SUMO在空間上的相互影響不同,SUMO能較好屏蔽(LfcinB)2,因此僅產(chǎn)生較弱的宿主細(xì)胞毒性. SUMO標(biāo)簽已廣泛用于抗菌肽的E.coli表達(dá)而避免了宿主細(xì)胞毒性,例如Cecropin A-LL37和Plectasin等抗菌肽[16-17]. 有研究認(rèn)為,SUMO標(biāo)簽?zāi)芡ㄟ^(guò)周圍親水和中心疏水核心結(jié)構(gòu)顯著提高融合抗菌肽的可溶性表達(dá)[18]. SUMO標(biāo)簽?zāi)苡行椭鞍踪|(zhì)折疊,顯著提高包括抗菌肽在內(nèi)的多種蛋白的可溶性表達(dá)[19-20]. 本研究也發(fā)現(xiàn),即使是2個(gè)LfcinB的串聯(lián)抗菌肽,SUMO標(biāo)簽也能實(shí)現(xiàn)90%的可溶性表達(dá).

2.3 SUMO-(LfcinB)n和LfcinB的蛋白純化

E.coli/pSUMO-(LfcinB)n經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,將超聲波破碎細(xì)胞的細(xì)胞上清液進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析,收集蛋白質(zhì)峰對(duì)應(yīng)樣品,SDS-PAGE電泳分析如圖3所示. 在SUMO-(LfcinB)n對(duì)應(yīng)分子量處均有一條明顯而單一的條帶. 因?yàn)镾UMO的N端有6×His-tag,經(jīng)His抗體的Western blotting分析進(jìn)一步證實(shí)純化產(chǎn)物為SUMO-(LfcinB)n融合蛋白. 在1 L的培養(yǎng)體系中,純化得到的SUMO-LfcinB、SUMO-(LfcinB)2和SUMO-(LfcinB)3的產(chǎn)量分別為69.1 mg、150 mg和57 mg. 用SUMO標(biāo)簽融合表達(dá)設(shè)計(jì)時(shí)通常在SUMO的N端添加(His)6-tag,以便于親和純化和檢測(cè)[21-22]. 本研究用(His)6-tag高效純化出SUMO-(LfcinB)n,以用于后續(xù)進(jìn)一步的切割與純化. 盡管多聚體串聯(lián)表達(dá)時(shí)隨著肽與載體的質(zhì)量比的增加,可能提高肽的產(chǎn)量和穩(wěn)定性. 本研究卻發(fā)現(xiàn),2個(gè)LfcinB串聯(lián)表達(dá)得到的產(chǎn)量高于單拷貝LfcinB和3拷貝 LfcinB 串聯(lián)表達(dá)的產(chǎn)量,可見SUMO融合蛋白的表達(dá)量與串聯(lián)拷貝數(shù)間并無(wú)線性正相關(guān). 有報(bào)道通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將蟹MT基因的2個(gè)和3個(gè)拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列整合在一起,采用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá),增加了重組MT蛋白的穩(wěn)定性和溶解性,并且顯著增強(qiáng)了Cu,Cd或Zn的耐受性和生物積累[23]. 因此,串聯(lián)表達(dá)是提高產(chǎn)量的有效方式. 然而,對(duì)于不同的分子,串聯(lián)數(shù)并非越多越好,最佳串聯(lián)數(shù)取決于融合標(biāo)簽和串聯(lián)肽的相互影響.

經(jīng)親和層析純化得到的SUMO-(LfcinB)n融合蛋白用SUMO酶在30 ℃酶切30 min,以釋放抗菌肽(LfcinB)n. Tricine-SDS-PAGE測(cè)定SUMO酶的酶切作用,結(jié)果如圖4所示. 可見SUMO酶能高效切割 SUMO-(LfcinB)n融合蛋白,釋放(LfcinB)n. 將SUMO-(LfcinB)2的SUMO酶切反應(yīng)體系用Ni2+-NTA進(jìn)行第二次親和純化,收集不能被Ni2+-NTA吸附的穿透峰樣品,再用羥氨切割釋放LfcinB,透析處理去除羥胺等小分子成分得到純化的樣品,經(jīng)電泳檢測(cè)為分子量約3.4 kDa的重組LfcinB,且在1 L的培養(yǎng)基中能得到約15 mg的重組LfcinB. SUMO酶是一種識(shí)別SUMO空間結(jié)構(gòu)并切除SUMO的特異性酶,無(wú)需添加任何酶切位點(diǎn),因此切割產(chǎn)物中無(wú)額外的氨基酸序列[24]. SUMO酶獨(dú)特的切割方式對(duì)表達(dá)小分子多肽非常有利,因?yàn)轭~外的氨基酸序列對(duì)小肽的功能影響可能比大分子蛋白更為顯著. 大量的研究顯示,SUMO酶切割釋放的抗菌肽具有很好的生物學(xué)活性[9],進(jìn)一步顯示SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)在抗菌肽基因工程領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì).

2.4 檢測(cè)重組LfcinB的抗菌活性

已有研究表明,天然LfcinB對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有抗菌作用[4]. 本研究對(duì)純化得到的重組LfcinB進(jìn)行抗Staphylococcusaureus活性鑒定,結(jié)果如圖5 所示. 瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果顯示,15 μmol/L 的重組LfcinB處理觀察到抑菌圈,25 μmol/L重組LfcinB處理的抑菌圈更為明顯,表明重組LfcinB具有對(duì)Staphylococcusaureus的抗菌活性. 已有多個(gè)研究報(bào)道,SUMO標(biāo)簽可溶性表達(dá)獲得的重組抗菌肽具有較好的抗菌活性[22,25]. 本研究采用SUMO融合2個(gè)拷貝的LfcinB串聯(lián)表達(dá),經(jīng)SUMO酶和羥胺切割后得到了具有抗菌活性的重組LfcinB,表明SUMO融合與串聯(lián)表達(dá)相結(jié)合的策略,可以得到具有生物學(xué)活性的重組抗菌肽.

2.5 重組LfcinB對(duì)腫瘤細(xì)胞PC12作用的分析

天然LfcinB對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抗癌活性[26]. 本研究選用大鼠PC12嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,評(píng)價(jià)重組LfcinB對(duì)PC12細(xì)胞的殺傷活性. 不同濃度的重組 LfcinB 對(duì)腫瘤細(xì)胞PC12 處理12 h后分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞分析,結(jié)果如圖6所示. PBS對(duì)照組的PC12細(xì)胞形態(tài)完好,25 μmol/L重組LfcinB處理12 h的PC12細(xì)胞形態(tài)模糊;而當(dāng)濃度提高到50 μmol/L,PC12發(fā)生碎片化,表明大部分細(xì)胞死亡. Annexin V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步揭示重組 LfcinB 對(duì)腫瘤細(xì)胞PC12的殺傷作用. 25 μmol/L重組LfcinB誘導(dǎo)11.77 %的PC12細(xì)胞凋亡,50 μmol/L的重組LfcinB可以誘導(dǎo)27.68 %的PC12細(xì)胞凋亡和23.67 %的PC12細(xì)胞壞死. 可見重組LfcinB對(duì)PC12細(xì)胞具有殺傷活性,能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡,高濃度的重組LfcinB還可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞壞死. 近年來(lái)越來(lái)越多的研究揭示LfcinB可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞的抗癌作用,LfcinB可以靶向V-H+-ATPase選擇性地殺傷高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞[27-28];LfcinB可以通過(guò)提高抑癌基因的表達(dá)、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成等多種途徑發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的選擇性抗癌作用[29]. LfcinB對(duì)多種惡性腫瘤的選擇性殺傷作用顯示出其在抗癌領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值. 本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得具有抗癌活性的重組LfcinB,將推動(dòng)LfcinB在抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用.

3 結(jié)論

本研究首次將SUMO標(biāo)簽融合和串聯(lián)表達(dá)相結(jié)合,利用同尾酶技術(shù)成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 通過(guò)在LfcinB串聯(lián)序列間設(shè)計(jì)羥氨切割位點(diǎn),利用SUMO酶和羥氨成功從SUMO-(LfcinB)n融合蛋白釋放出重組LfcinB單體. 研究認(rèn)為SUMO標(biāo)簽?zāi)茱@著促進(jìn)SUMO-(LfcinB)n的可溶性表達(dá),并能在一定程度上避免(LfcinB)n的宿主細(xì)胞毒性,其中2個(gè)拷貝基因串聯(lián)的宿主細(xì)胞毒性最低,產(chǎn)量最高. 獲得的重組LfcinB對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定的抑菌作用,對(duì)大鼠PC12嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞具有促凋亡和壞死效應(yīng). 2個(gè)拷貝的基因串聯(lián)對(duì)采用pSUMO-(LfcinB)n系統(tǒng)原核表達(dá)LfcinB優(yōu)于單拷貝和3拷貝串聯(lián). 多拷貝表達(dá)策略能在一定程度上提高目的蛋白的表達(dá)量,但不是絕對(duì)的,即表達(dá)量和拷貝數(shù)不成正比,其具體原因和機(jī)理有待于進(jìn)一步探討和研究. 本研究首次將SUMO融合與串連表達(dá)策略用于抗菌肽LfcinB的大腸桿菌基因工程,為生產(chǎn)具有抗菌和抗癌活性的抗菌肽應(yīng)用于臨床提供了有效的方法.