木豆葉提取物對股骨頭壞死大鼠血液流變學(xué)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響

趙飛，姚忠軍，胡炳炎，劉東

股骨頭壞死是骨科常見且難治性疾病，30～50歲人群的發(fā)病率較高[1]，病情進(jìn)展速度快，若未及時(shí)干預(yù)治療，可在短短幾年內(nèi)發(fā)展為股骨塌陷或髖關(guān)節(jié)繼發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎，只能采取髖關(guān)節(jié)置換術(shù)救治，但髖關(guān)節(jié)置換術(shù)費(fèi)用較高[2]。目前對股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制認(rèn)識尚未清楚，導(dǎo)致其治療難度大且療效不明顯[3]，既往研究顯示，中醫(yī)治療股骨頭壞死具有一定的療效且安全性好[4-5]。木豆葉是豆科木豆屬植物木豆的莖葉，具有消腫解毒的功效，對股骨頭缺血性壞死有顯著預(yù)防作用[6]。股骨頭壞死危險(xiǎn)因素較多，包括使用糖皮質(zhì)激素、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)移位及酗酒等[7]。本研究通過構(gòu)建激素性股骨頭壞死大鼠，觀察木豆葉提取物對股骨頭壞死大鼠血液流變學(xué)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化的影響，為臨床木豆葉提取物治療股骨頭壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： SPF級雄性SD大鼠50只，4周齡，體質(zhì)量(190±20)g，購于中山大學(xué)東校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵)2016-0029]，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)，培育室溫度20～25 ℃，濕度50 %～55 %，進(jìn)行人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，大鼠全天自由飲水。(2)藥物與試劑：甲基強(qiáng)的松龍(美國Target Molecule Corp公司)，木豆葉提取物采用通絡(luò)生骨膠囊，購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司。大腸桿菌脂多糖(美國Sigma公司)，三酰甘油(中國上海朗頓生物科技有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、大鼠骨鈣素(BGP)ELISA試劑盒(中國上海恒斐生物科技有限公司)。 (3)儀器：冷凍離心機(jī)(5702R型，德國Eppendorf公司)，輪盤式切片機(jī)(RM2016型，德國LEICA公司)，多功能酶標(biāo)儀(EnVision型，英國珀金埃爾默公司)，顯微鏡(LV-150N型，日本NIKON公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠模型制備及干預(yù): 2017年10月—2018年12月于湖北省十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只 ，參考文獻(xiàn)[8]將后4組大鼠用于激素性股骨頭壞死動物模型制備：大鼠尾靜脈注射大腸桿菌脂多糖40 μg/kg，1次/d，連續(xù)注射2 d，末次注射后次日予甲基強(qiáng)的松龍20 mg/kg臀肌注射，1次/d，連續(xù)注射3 d；對照組大鼠注射等劑量的生理鹽水。在建模的同時(shí)，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予通絡(luò)生骨膠囊混懸液0.48、0.96、1.44 g/kg灌胃干預(yù)，1次/d，對照組等體積的生理鹽水灌胃，均連續(xù)干預(yù)4周。大鼠股骨頭肉眼可見軟骨面存在缺損，壞死面顯露并且髓腔內(nèi)存在脂肪堆積等變化[9]，表明模型制備成功。

1.2.2 BMSCs分離培養(yǎng): 各組大鼠麻醉處死，于無菌條件下分離股骨與脛骨，去除附著肌肉組織，去掉兩端干骺端，采用10%PBS、IMDM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至發(fā)白，收集洗滌液，無菌網(wǎng)過濾，其中液體培養(yǎng)于6孔板中，37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞鋪滿近80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代BMSCs用于分化實(shí)驗(yàn)。同時(shí)取對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠干預(yù)結(jié)束后2 h的心臟血3 ml，于4 ℃離心收集上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BMSCs分化干預(yù): 將第3代BMSCs分為空白組、處理組。處理組分為3個(gè)亞組，分別為低劑量亞組、中劑量亞組、高劑量亞組，每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，其中培養(yǎng)基中分別加入1.2.2所述的含藥血清，空白組不做藥物處理，參考文獻(xiàn)[10]中的方法，連續(xù)干預(yù)1周。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血液黏度及凝血指標(biāo)檢測：于大鼠給藥干預(yù)結(jié)束后2 h，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，采取心臟血3 ml置于含有肝素的抗凝管中備測，采用全自動分析儀檢測全血黏度、血漿黏度，凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)。

1.3.2 骨組織病理學(xué)觀察： 藥物連續(xù)干預(yù)4周后，麻醉處死各組大鼠，切開皮膚，分離肌肉組織，暴露關(guān)節(jié)囊，取出右側(cè)股骨頭并置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木精—伊紅(HE)染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3.3 TG、ALP、BGP檢測：各組含藥血清干預(yù)結(jié)束后，收集BMSCs細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，沉淀細(xì)胞并收集，裂解細(xì)胞，3 000 r/min離心30 min，收集上清液，按照TG、ALP、BGP試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 鈣化結(jié)節(jié)面積檢測：采用硝酸銀染色觀察各組鈣化結(jié)節(jié)情況，BMSCs分化干預(yù)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，5%硫代硫酸鈉作用30 min，再用蒸餾水漂洗3次，1%硝酸銀UV染色30 min，蒸餾水沖洗掉黑色物質(zhì)，5%硫代硫酸鈉作用2 min，1%中性紅復(fù)染10 min，蒸餾水漂洗，在Polarid DMCⅡ圖像分析儀下進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)面積觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組血液流變學(xué)指標(biāo)比較 與對照組比較，模型組大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血漿黏度均增加(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組均降低(P<0.05)；隨著木豆葉濃度增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血液黏度逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

2.2 各組凝血功能比較 與對照組比較， 模型組大鼠PT、APTT、TT均降低(P<0.01)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組均升高(P<0.05)；隨著木豆葉濃度增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組凝血時(shí)間逐漸增加(P均<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

2.3 各組骨組織病理學(xué)比較 對照組大鼠股骨頭軟骨細(xì)胞排列有序，骨小梁完整，空骨陷窩較少，未見細(xì)胞壞死。模型組大鼠股骨頭軟骨細(xì)胞排列紊亂且肥大，骨小梁變窄，有空骨陷窩，脂肪細(xì)胞變大，可見明顯壞死細(xì)胞。低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠股骨頭損傷情況得到改善，其中高劑量組大鼠股骨頭改善狀況更明顯，見圖1。

2.4 BMSCs分化比較 與空白組比較，處理組(低劑量亞組、中劑量亞組、高劑量亞組)的BGP水平、鈣化結(jié)節(jié)面積及ALP活性升高，TG水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著木豆葉含藥血清濃度增加， BGP水平、鈣化結(jié)節(jié)面積及ALP活性也逐漸升高，TG水平逐漸降低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

股骨頭壞死屬于退行性、破壞性骨病，其病程時(shí)間長且致殘率較高，嚴(yán)重影響患者日常生活。目前對股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但普遍接受血管內(nèi)凝血學(xué)說、脂代謝紊亂學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說及激素毒性作用等，盡管各種學(xué)說的側(cè)重點(diǎn)不一，但最終都會影響骨微循環(huán)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠比較，激素性股骨頭壞死大鼠全血黏度呈現(xiàn)出升高狀態(tài)，而PT、APTT、TT降低，由此表明激素性股骨頭壞死大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高凝狀態(tài)。高凝狀態(tài)、高游離脂肪酸會加快血管內(nèi)皮損傷，使血管局部凝血加重，促使軟骨下微循環(huán)障礙、血栓形成，升高骨內(nèi)壓、減少血流量，引起缺血缺氧，最終形成股骨頭壞死[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)通過木豆葉提取物干預(yù)后可以明顯降低激素性股骨頭壞死大鼠全血黏度，并且還可以延長PT、APTT、TT時(shí)間，可能是因?yàn)槟径谷~本身具有消腫止痛、活血化瘀等作用，改善激素性股骨頭壞死大鼠的血循環(huán)狀態(tài)，從而改善激素性股骨頭壞死大鼠高凝狀態(tài)。

表1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

表3 各組大鼠BMSCs分化情況比較

組 別nBGP(μg/L)鈣化結(jié)節(jié)面積(mm2)TG(μg/ml)ALP(U/ml)空白組6214.31±13.2532.11±3.042.89±0.21129.62±8.64處理組 低劑量亞組6233.67±12.34 36.25±2.65 2.11±0.23 141.65±9.44 中劑量亞組6250.41±13.36 40.21±3.44 1.83±0.16 155.99±9.62 高劑量亞組6269.84±14.32 45.83±3.69 1.52±0.14 168.27±9.03 F/P值18.914/0.00019.659/0.00058.108/0.00020.140/0.000

經(jīng)過對激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭病理檢查發(fā)現(xiàn)染色，股骨頭表現(xiàn)出壞死、骨小梁空骨陷窩、骨細(xì)胞壞死、脂肪細(xì)胞增大等病理癥狀，而經(jīng)過木豆葉提取物干預(yù)處理可以改善上述病理癥狀，并且隨著作用濃度的增加改善程度越明顯。有研究顯示[13]，由木豆葉單味藥組成的通絡(luò)生骨膠囊可以促進(jìn)新西蘭兔激素性股骨頭壞死修復(fù)，減少股骨頭壞死的發(fā)生率，本研究結(jié)果也支持其觀點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為氣血在股骨滋養(yǎng)、骨質(zhì)正常形態(tài)及其功能的維持中具有重要作用，木豆葉不僅具有活血化瘀的功效，還具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗骨質(zhì)疏松等作用，化學(xué)成分主要有黃酮類、芪類、豆甾醇、兒茶酚、水楊酸等[14-15]，其中木豆葉芪類通過影響膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)對膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用及血管保護(hù)作用，木豆葉黃酮類還可以促進(jìn)新生骨鈣的沉積及磷含量，增強(qiáng)對股骨頭壞死部分的修復(fù)作用，此外，木豆葉中還含有豆甾醇、兒茶酚、水楊酸等物質(zhì)，但能否對激素性股骨頭壞死有改善作用，還需要進(jìn)一步研究。由此表明，木豆葉提取物對激素性股骨頭壞死有改善作用，推測可能與影響骨鈣沉積或BMSCs分化有關(guān)。

本研究通過激素性股骨頭壞死大鼠模型制備BMSCs，經(jīng)含木豆葉提取物血清干預(yù)后，BMSCs中TG水平減低，而ALP活力、骨鈣素水平、鈣化結(jié)節(jié)面積明顯升高。BMSCs起源于骨髓成體干細(xì)胞，具有增殖、多向分化功能，經(jīng)不同誘導(dǎo)因素刺激可以分化成神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等[16]。BMSCs具有向成骨分化、成脂分化的能力，脂肪細(xì)胞主要特點(diǎn)為合成并存儲TG，所以TG可以反映BMSCs成脂分化情況。ALP是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的早期重要指標(biāo)，ALP活性也直接反映BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。BMSCs向成骨細(xì)胞分化的最終表現(xiàn)為鈣化，鈣化結(jié)節(jié)可以反映最終鈣化情況。劉長河等[17]研究顯示，木豆葉提取物可以較好改善維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松，增加股骨、椎骨的骨鈣水平。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，大量激素作用可以促進(jìn)BMSCs脂肪代謝紊亂、分化異常，血液的黏稠度增加，血脂水平異常升高，血栓形成引起栓塞，導(dǎo)致股骨頭供血不足，從而引起骨細(xì)胞壞死。木豆葉提取物對BMSCs成骨分化有促進(jìn)作用，可能是提高了BMSCs的應(yīng)激性及自我保護(hù)，抑制BMSCs凋亡，還有可能是通過影響MAPK途徑[18]，但其中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，木豆葉提取物對激素性股骨頭壞死大鼠的血液黏度、凝血功能有一定的改善作用，可能通過增強(qiáng)BMSCs向成骨分化能力，促進(jìn)激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭壞死修復(fù)。