黃芪多糖通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制COPD大鼠炎性反應(yīng)誘導(dǎo)的平均血小板體積降低

曹亮，劉建華，馮平，趙建清

平均血小板體積(MPV)是檢測(cè)血小板活化的替代指標(biāo)[1]。前炎性因子和急時(shí)相反應(yīng)物產(chǎn)生過(guò)多可通過(guò)干擾巨核細(xì)胞功能，使骨髓釋放出小體積血小板。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由多種炎性細(xì)胞、炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)性疾病，COPD急性加重(AECOPD)是導(dǎo)致患者住院治療和死亡的重要原因之一。以往研究發(fā)現(xiàn)[2]，AECOPD恢復(fù)期患者M(jìn)PV減小，且減小程度與AECOPD病情嚴(yán)重程度相關(guān)。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要活性成分之一，對(duì)肺組織炎性反應(yīng)損傷有保護(hù)作用[3]。ASP對(duì)抑制COPD炎性反應(yīng)的研究尚不多見(jiàn)，現(xiàn)分析ASP抗炎程度與MPV變化的關(guān)系，為MPV能夠有效評(píng)估COPD病情嚴(yán)重程度提供依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCKK(冀)2013-1-003。大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，平均溫度25℃，相對(duì)濕度65%～70%，光照12 h。(2)藥物與試劑：烏拉坦(購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠)、青霉素(購(gòu)自東北制藥公司)、鏈霉素(購(gòu)自山東魯抗制藥股份有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司)， ELISA試劑盒(購(gòu)自上海信帆生物有限公司)，人巨核細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞(購(gòu)自上海一研生物科技有限公司)。(3)儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)(購(gòu)自長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司，型號(hào) TG22-WS)、全自動(dòng)血液分析儀(購(gòu)自廈門(mén)海菲生物技術(shù)有限公司，型號(hào) BC-3300CT)、醫(yī)用生物顯微鏡(購(gòu)自云南遠(yuǎn)錦光學(xué)儀器有限公司，型號(hào) XSB)、LQS酶標(biāo)儀(購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)SP21-318C)、凝膠成像儀(購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào) ZF-288)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年12月—2020年2月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 COPD模型大鼠制備與分組： 60只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即空白對(duì)照組，模型組，黃芪多糖400、600、800 mg/kg組和潑尼松(6 mg/kg)組，每組10只。COPD大鼠造模方法參考文獻(xiàn)[4]：于第1日、14日實(shí)施麻醉后經(jīng)氣管注入脂多糖(LPS，1 g/L)200 μl，第2～28日(不含第14日)置于密封的煙室中，每日吸入香煙煙霧(含焦油19 mg、尼古丁1.2 mg)1次，每次持續(xù)吸入30 min。黃芪多糖各組與潑尼松組每天注入脂多糖或吸煙前給予不同劑量黃芪多糖及潑尼松灌胃；空白對(duì)照組、模型組平行給予生理鹽水灌胃。胸部X線(xiàn)攝片出現(xiàn)兩側(cè)膈肌下降、肋間隙增寬、肺野透亮度增加，表明COPD大鼠造模成功[5]。

1.2.2 骨髓巨核細(xì)胞培養(yǎng)與分組： 為進(jìn)一步明確黃芪多糖促進(jìn)骨髓巨核細(xì)胞成熟的作用是直接的，亦或是間接的，因此另取人巨核細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以促血小板生成素(TPO)為陽(yáng)性對(duì)照，觀察黃芪多糖能否直接促進(jìn)大鼠中骨髓巨核細(xì)胞的成熟。從液氮罐中取出具有晚期成熟性狀的人巨核細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)，置于37 ℃水浴中快速解凍，然后加PBS于室溫下1 000 r/min離心5 min，PBS重懸洗滌細(xì)胞3次并離心除去PBS，細(xì)胞用改良RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml)重懸，輕輕吹打至單細(xì)胞懸液，再移至培養(yǎng)皿中置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用新鮮培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液后進(jìn)行分皿，加培養(yǎng)基到合適密度傳代細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將對(duì)數(shù)期的Meg-01細(xì)胞分為6組[6]。(1)對(duì)照組：含10%胎牛血清的伊思柯夫改良培養(yǎng)液(IMDM)培養(yǎng)基。(2)黃芪多糖組：黃芪多糖100 mg/L+IMDM培養(yǎng)基。(3)白介素1β(IL-1β)組：IL-1β 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(4)白介素8(IL-8)組：IL-8 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(5)腫瘤壞死因子α(TNF-α)組：TNF-α 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(6)TPO組：TPO 50 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。Meg-01細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于24孔板，加入相應(yīng)培養(yǎng)液，5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 大鼠骨髓巨核細(xì)胞采集與形態(tài)觀察： 將大鼠脫臼處死，迅速剝離雙側(cè)股骨，剪斷股骨兩端，在培養(yǎng)皿中用裝有 PBS 洗液的 1ml 注射器，向骨髓腔內(nèi)快速推入，反復(fù)沖洗骨髓細(xì)胞，直至股骨外觀呈白色時(shí)骨髓全部沖出。用1 ml空針頭將含有骨髓的液體過(guò)濾至離心管中， 2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，取下層骨髓沉淀迅速涂片。風(fēng)干后瑞氏染色 5 min，流水沖洗，室溫晾干。每張骨髓片以直徑6 mm范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目為基準(zhǔn)，光鏡下觀察并計(jì)算全片巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 大鼠MPV測(cè)量： 對(duì)每只大鼠使用尾尖采血法取血液2 ml，固定動(dòng)物并析出鼠尾，將鼠尾在45℃溫水中浸泡數(shù)分鐘，也可用二甲苯等化學(xué)藥物涂擦，使局部血管擴(kuò)張。將鼠尾擦干，剪去尾尖，血自尾尖流出，讓血液滴入盛器或直接用移液器吸取。將血液于抗凝管中，采用BC 3000CT全自動(dòng)血液分析儀(深圳邁瑞)測(cè)量血樣中MPV。

1.2.5 大鼠血清炎性因子檢測(cè)：大鼠腹腔注射25%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈采血8 ml，1 500 r/min離心20 min，取血清。以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)肺組織中Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)：獲取大鼠肺組織細(xì)胞，用PBS洗滌3次，用試劑盒提取蛋白后，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離，分離的蛋白在200 mA下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，4℃下用5%脫脂牛奶封閉膜過(guò)夜，一抗(1 ︰1 000 TLR4，1 ︰1 500 NF-κB，1 ︰1 000 β-actin)4℃孵育過(guò)夜，洗膜后換HRP標(biāo)記Ⅱ抗室溫孵育2 h。將漂洗后的膜放入干凈的皿中，暗室中吸取等量發(fā)光試劑A液與B液并混勻，然后均勻澆注在PVDF膜蛋白面上，數(shù)秒后用凝膠成像儀分析，Image J軟件分析TLR4、NF-κB 灰度值。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織中炎性因子mRNA表達(dá)： 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)要求提取總RNA并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)肺組織中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA的相對(duì)水平。所有引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，見(jiàn)表1。檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 血小板膜糖蛋白CD41(CD41)、血小板膜糖蛋白Ⅰba(GPIba)表達(dá)的測(cè)定：收集Meg-01細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml。取細(xì)胞懸液各20 μl，PE-anti-human CD41試劑1 ︰10稀釋后加入到細(xì)胞懸液中，37℃溫箱中孵育30 min，加PBS至400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD41的表達(dá)。另取細(xì)胞懸液各50 μl，加入SE-2抗體2 μg/ml于37℃溫箱中孵育30 min，山羊抗小鼠IgG(H+L)FITC試劑1 ︰200稀釋后加入細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，37 ℃溫箱中孵育30 min后加PBS至400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GPIba。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠表現(xiàn)特點(diǎn)比較 空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食、呼吸正常；模型組大鼠精神不振、反應(yīng)遲鈍，食欲降低、體質(zhì)消瘦，伴有咳嗽、哮鳴音、痰鳴音等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)；潑尼松組大鼠精神狀態(tài)、呼吸、飲食均得到改善；各黃芪多糖組隨劑量升高，大鼠病情緩解更加明顯，800 mg/kg時(shí)改善最為顯著。

2.2 各組大鼠骨髓巨核細(xì)胞及MPV比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠骨髓巨核細(xì)胞總數(shù)顯著增加，產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)量顯著降低，MPV顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組大鼠巨核細(xì)胞總數(shù)減少、產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)顯著增加，MPV顯著升高(F=12.086、13.051、18.265，P<0.001)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)、MPV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

2.3 各組大鼠血清炎性因子表達(dá)量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-8、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組IL-1β、IL-8、TNF-α顯著降低(F=15.028、14.581、16.082，P均<0.001)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組血清炎性因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP>0.05

圖1 各組大鼠骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)(鈣鹽染色，×400) 表2 各組大鼠骨髓巨核細(xì)胞及MPV比較

組 別n巨核細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/mm2)產(chǎn)板巨核細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)MPV(fl)空白對(duì)照組1054.20±3.6816.20±2.557.67±0.49模型組1085.60±6.09a2.50±0.63a6.21±0.55a潑尼松組1058.70±5.16b15.30±3.05b7.52±0.38b黃芪多糖400 mg/kg組1071.90±5.39b5.70±2.56b6.48±0.40b黃芪多糖600 mg/kg組1066.02±3.66b10.80±2.53b7.02±0.36b黃芪多糖800 mg/kg組1061.11±4.97bc14.70±2.91bc7.22±0.41bcF值12.08613.05118.265P值<0.001<0.001<0.001

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP>0.05

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP<0.05

圖2 各組大鼠肺組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

2.5 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP<0.05

圖3 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)比較

2.6 人巨核細(xì)胞株Meg-01分化標(biāo)記物CD41、GPIba表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，IL-1β組、IL-8組、TNF-α組巨核系Meg-01細(xì)胞CD41、GPⅠba的表達(dá)顯著下調(diào)，其中TNF-α下調(diào)幅度最大(F=21.620，P<0.001)；TPO組巨核系Meg-01細(xì)胞CD41、GPⅠba的表達(dá)上調(diào)(F=15.231，P<0.001);與對(duì)照組比較,黃芪多糖組細(xì)胞CD41、GPⅠba的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.869，P=0.123)，見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01圖4 各組Meg-01巨核細(xì)胞 CD41、GPⅠba的表達(dá)

3 討 論

平均血小板體積(MPV)是反映血小板活化程度的指標(biāo)，在急性心肌梗死、高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等具有指導(dǎo)意義，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-9]。由于MPV的變化可反映感染、炎性反應(yīng)、免疫等慢性病嚴(yán)重程度[10-11]，近年來(lái)MPV評(píng)估COPD病情嚴(yán)重程度的研究也逐漸增多[12]。COPD患者由于肺血管收縮、血流減慢，常存在缺氧、感染、酸中毒等癥狀，大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，使局部及全身炎性反應(yīng)水平加重[13-16]。

肺主呼吸，朝百脈，匯聚氣血。氣虛、血瘀是引發(fā)肺病的重要病理基礎(chǔ)，肺氣虧虛是COPD病機(jī)之本。黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫，其主要活性成分之一黃芪多糖，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制細(xì)胞分泌炎性因子的作用[17]，對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有明顯抑制作用[18]。為探究黃芪多糖對(duì)COPD的改善作用，分別給予COPD大鼠黃芪多糖400、600、800 mg/kg灌胃，以潑尼松為陽(yáng)性藥對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，給予黃芪多糖各組大鼠相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α及TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白水平顯著降低。

IL-8、TNF-α在COPD炎性反應(yīng)進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[19-20]，是氣道炎性因子網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。IL-1β作為前炎性介質(zhì)因子，一方面能夠激活免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化；另一方面促進(jìn)中性粒細(xì)胞溶體酶的釋放，產(chǎn)生大量氧自由基，促進(jìn)IL-1、IL-6等炎性介質(zhì)釋放，加重炎性反應(yīng)。在COPD氣道及全身炎性反應(yīng)中，IL-1β、IL-8、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受上游NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)[21]。齊詠[22]、孫雪皎等[23]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期重度COPD患者血清IL-8、TNF-α、NF-κB表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組。生理?xiàng)l件下，NF-κB主要以p65/p50二聚體形式存在細(xì)胞質(zhì)中與抑制蛋白I-κBα結(jié)合成無(wú)活性的三聚體。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，I-κB激酶被激活后，使I-κBα被磷酸化后發(fā)生泛素化而被蛋白酶體降解。由于I-κBα對(duì)p65/p50二聚體抑制作用解除，p65/p50二聚體NLS暴露而被轉(zhuǎn)入核內(nèi)，激活下游炎性基因。

為進(jìn)一步明確黃芪多糖是否直接對(duì)骨髓巨核細(xì)胞有直接促成熟作用，取人巨核細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以TPO為陽(yáng)性對(duì)照，CD41和GPⅠba表達(dá)水平作為觀察指標(biāo)。TPO是調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞分化和生成血小板的關(guān)鍵因子[24]。CD41被認(rèn)為是巨核細(xì)胞或血小板特有的標(biāo)志[25]；GPⅠba是巨核細(xì)胞向血小板分化過(guò)程中，血小板表面逐漸增加的糖蛋白，對(duì)參與血小板黏附等生理功能起重要作用，對(duì)GPⅠba表達(dá)分析有助于識(shí)別巨核細(xì)胞的分化程度[26]。結(jié)果表明黃芪多糖先抑制炎性因子的表達(dá)，炎性因子再促進(jìn)骨髓巨核細(xì)胞的成熟，表明如何有效抑制炎性因子是未來(lái)治療COPD的重要研究方向，同時(shí)炎性因子表達(dá)水平也是將黃芪多糖運(yùn)用于臨床時(shí)評(píng)估療效的重要指標(biāo)。

綜上所述，黃芪多糖通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路減輕COPD大鼠炎性反應(yīng)并使MPV升高，而MPV隨著炎性反應(yīng)劇烈程度的增加而降低，通過(guò)MPV可有效評(píng)估COPD炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度。