高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測(cè)定魚肉罐頭中甲基汞的不確定度分析

趙娜娜 袁堃 周賽靜

摘要 采用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測(cè)定魚肉罐頭中甲基汞含量，通過建立不確定度評(píng)估的數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的主要來源，并對(duì)各不確定度分量、合成不確定度和擴(kuò)展不確定度進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，樣品中甲基汞含量為0.048 mg/kg，其擴(kuò)展不確定度為0.004 6 mg/kg（k=2），不確定度主要來源是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、測(cè)量重復(fù)性和提取效率，其中影響不確定度的最大因素是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，樣品稱量對(duì)不確定度影響最小。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法;甲基汞;不確定度;金槍魚罐頭

Abstract The content of methylmercury in tinned tuna was determined by high performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry （HPLCAFS）.The sources of uncertainty in the measurement process by mathematical modeling were systematically analyzed.The main uncertainty components，combined uncertainty and expanded uncertainty for the determination of methylmercury were calculated.The results showed that when the content of methylmercury in tinned tuna was 0.048 mg/kg，and the extended uncertainty was 0.004 6 mg/kg（k=2）.The major factors which affected the uncertainty came from standard curve fitting，standard solution preparation，sample repeatability tests and extraction efficiency.The most important factor which affected the uncertainty was standard curve fitting，followed by standard solution preparation.The influence of the sample weighing on the uncertainty was the smallest.

Key words High performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry （HPLCAFS）;Methylmercury;Uncertainty;Tinned tuna

汞及其化合物在環(huán)境中普遍存在，因其具有的高致毒性、持久性和長距離遷移性等特點(diǎn)，是一種全世界公認(rèn)的持久性有毒物質(zhì)（persistent toxic substance，PTS）[1]。食品中的汞主要以無機(jī)汞和有機(jī)汞的形態(tài)存在，其中，有機(jī)汞的毒性是無機(jī)汞的幾百倍，而在有機(jī)汞中甲基汞的毒性最大。無機(jī)汞可以通過生物甲基化或者光化學(xué)反應(yīng)等過程轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的甲基汞[2-7]。甲基汞主要損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)胎兒也有明顯的致畸作用。由于環(huán)境的污染和生物鏈的富集作用，水產(chǎn)動(dòng)物及其制品易受甲基汞的污染[8-11]。

筆者以基質(zhì)復(fù)雜的魚肉罐頭為研究對(duì)象，采用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用方法測(cè)定其甲基汞含量，并依據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[12]對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估。該試驗(yàn)是以日常檢測(cè)工作為基礎(chǔ)建立的評(píng)定方法，可以真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的置信水平，給出結(jié)果判定的風(fēng)險(xiǎn)，為檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用（中國吉天SA-50）;高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）;振蕩器（德國IKA）;XPE-205電子天平（中國梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：甲基汞溶液（65.0±2.5）μg/g，中國計(jì)量科學(xué)研究院; 乙腈、乙酸銨為色譜純，鹽酸、氨水為優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件。

色譜柱：C18柱（柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）;流動(dòng)相：0.06 mol/L乙酸銨 +0.1% L-半胱氨酸+5%乙腈;流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量：100 μL。

1.2.2 光譜條件。負(fù)高壓：280 V;燈電流：30 mA;載氣流速：300 mL/min;屏蔽氣流速：600 mL/min;泵速：65 r/min;載流：7%鹽酸;還原劑：2% KBH4-0.5%KOH混合液;氧化劑：0.2%K2S2O8-0.5%KOH混合液。

1.3 檢驗(yàn)方法 依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.17—2014 《食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》[13]第二篇食品中甲基汞的測(cè)定。

1.3.1 樣品前處理。

準(zhǔn)確稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于高速離心管中，加入鹽酸溶液（5 mol/L）10 mL，渦旋混勻，放置過夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間振搖數(shù)次，離心15 min（4 ℃，8 000 r/min）。準(zhǔn)確吸取2.0 mL上清液至5 mL 容量瓶中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）調(diào)節(jié)樣液pH為2～7。加入0.1 mL的L-半胱氨酸溶液（10 g/L），用水定容至刻度。經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。按同一操作方法作空白試驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

稱取甲基汞溶液0.769 2 g于50 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，搖勻，得濃度為1.0 μg/mL的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用100～1 000 μL移液槍移取1.00 mL 儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，得濃度為100 ng/mL的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別移取 0、100、200、400、600、1 000 μL的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL）至10 mL容量瓶中，用純水稀釋定容至刻度，得到濃度分別為0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型的建立。金槍魚罐頭中甲基汞含量計(jì)算公式如下：

式中，X為樣品中甲基汞的含量（mg/kg）;C0為空白溶液中甲基汞濃度（ng/mL）;C為試樣溶液中甲基汞濃度（ng/mL）;V為試樣提取液體積（mL）;m為試樣質(zhì)量（g）;1 000為換算系數(shù);frec為回收率校正因子。

2 不確定度的分析

根據(jù)測(cè)量過程和數(shù)學(xué)模型分析，影響魚肉罐頭中甲基汞含量結(jié)果不確定度的因素主要包括稱樣量、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品測(cè)定重復(fù)性、回收率。

2.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m） 樣品的稱樣量為m=1.0 g，天平的最大允許誤差為±0.1 mg，為B類評(píng)定，按矩形分布，k=3，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U1（m）=a/k=0.000 057 7。由于樣品稱量包括空杯清零和實(shí)際樣品稱量2次操作，計(jì)算稱量2次的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（m）=U20（m）+U21（m）=0.000 081 6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（m）=U（m）/m=0.000 081 6。

2.2 樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V） 樣品提取過程中用到了10 mL移液器（加鹽酸10 mL）、5 mL移液器（吸取2.0 mL上清液）和5 mL容量瓶（定容），分別計(jì)算其不確定度。

依據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[14]，10 mL移液器的最大允許誤差為0.6%，5 mL移液器的最大允許誤差為0.5%，按矩形分布，k=3，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：Urel（V10 mL）=0.6%3=0.003 46、Urel（V5 mL）=0.5%3=0.002 89。

樣品處理完成后定容至5 mL容量瓶中，不確定度主要來源包括：①容量瓶最大允許誤差引入的不確定度Urel（V1′），依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[15]，A級(jí)5 mL容量瓶的最大允許誤差為±0.020 mL，按三角分布，k=6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（V1′）=0.0206×5=0.001 63;②溫度誤差引入的不確定度Urel（T1′），實(shí)驗(yàn)室溫度變化范圍為（20±5）℃，水在20 ℃的膨脹系數(shù)為α=2.1×10-4℃-1，由溫度變化引起溶劑體積改變的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（T1′）=ΔV/k=（V×ΔT×α）/k，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel（T1′）=0.000 606。5 mL 容量瓶的合成相對(duì)不確定度為Urel（V5 mL）=U2rel（V1′）+U2rel（T1′）=0.001 74。樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（V′）=U2rel（V10 mL）+U2rel（V5 mL）+U2rel（V5 mL′）=0.004 83。

2.3 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（C）

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（CS）。甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為中國計(jì)量科學(xué)研究院提供，甲基汞含量為65.0 μg/g，其擴(kuò)展不確定度為2.5 μg/g，k=2，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（Cs）=2.565.0×2=0.019 2。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m1）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱樣量為0.769 2 g，天平的最大允許誤差為±0.1 mg，按矩形分布處理，k=3，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在2次稱量過程（清零和實(shí)際稱量）中產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：Urel（m1）=0.000 1×23×0.769 2=0.000 106。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度Urel（VC）。

該項(xiàng)不確定度主要來源包括量器最大允許誤差引入的不確定度Urel（V）、溫度誤差引入的不確定度Urel （T）。實(shí)驗(yàn)室溫度變化范圍為（20±5）℃，水在20 ℃的膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1。標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器容量最大允許誤差引入的不確定度見表1，溫度誤差引入的不確定度見表2，各量器相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

綜上所述，甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度：Urel（C）=U2rel（CS）+U2rel（m1）+U2rel（VC）=0.026 9。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（Cstd）

利用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀對(duì)濃度分別為1、2、4、6、10 μg/L 的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行峰面積的測(cè)定，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定2 次，采用線性最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果詳見表4。同時(shí)對(duì)魚罐頭樣品在進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，根據(jù)如下公式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程中引入的不確定度進(jìn)行計(jì)算：

式中，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，p 為測(cè)定樣液的測(cè)定次數(shù)， p=6;m為每個(gè)濃度點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)，m=2;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)的總數(shù)， n=5;

C0為樣品中甲基汞的質(zhì)量濃度的平均值，C0=1.85 μg/L;Cij為標(biāo)準(zhǔn)溶液各校準(zhǔn)點(diǎn)的濃度;C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中校準(zhǔn)點(diǎn)Cij的質(zhì)量濃度平均值;Sij為各質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)定的峰面積;Si為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的各質(zhì)量濃度點(diǎn)的峰面積。根據(jù)表4的數(shù)據(jù)計(jì)算S（S）=2 282、SC=102.4、U（Cstd）=0.060 7、Urel（Cstd）=U（Cstd）C0=0.032 8。

2.5 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（Rep） 在重復(fù)性條件下，對(duì)魚肉罐頭中甲基汞的含量進(jìn)行了6次獨(dú)立試驗(yàn)（n=6），所得測(cè)量數(shù)據(jù)見表5。由表5計(jì)算魚肉罐頭中甲基汞含量的平均值為=0.044 1 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=0.001 86，由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：Urel（Rep）=sn×=0.017 2。

2.6 提取效率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（Rec）

由于樣品提取不完全或提取過程中導(dǎo)致甲基汞的損失等，使魚肉罐頭中的甲基汞不能100%進(jìn)入到測(cè)定液中，因此，該試驗(yàn)在試樣中添加3組不同含量的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05、0.10、0.15 mg/kg），考察回收率對(duì)不確定度的影響，即用回收率平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估樣品提取效率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。同時(shí)根據(jù)t檢驗(yàn)判斷平均回收率與100%是否有顯著性差異。

經(jīng)計(jì)算，甲基汞的平均回收率為Rec=91.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S（Rec）=3.13%。查t檢驗(yàn)臨界值分布表JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[12]，t（95，n-1）=t（95，8）=2.31，該試驗(yàn)中t值8.34大于t（95，8），因此，該試驗(yàn)的回收率與100%有顯著性差異，必須在計(jì)算結(jié)果的公式中乘以回收率校正因子（frec=1Rec）對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正，最后得出Urel（Rec）=S（Rec）Rec×n=0.011 4。

2.7 合成不確定度 將各不確定度分量來源及量值列于表6。

從表6可以看出，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大的不確定度來源是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測(cè)量重復(fù)性和提取效率，樣品稱量和定容引入的相對(duì)不確定度較小。各不確定度分量相互獨(dú)立，因此，合成相對(duì)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：U（X）=Urel（X）×X=0.002 3（X為表5的樣品測(cè)定濃度按照甲基汞計(jì)算公式得到的平均值）。依據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[16]，在0.05的置信水平下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×U（X）=0.004 6。魚肉罐頭中甲基汞的測(cè)定結(jié)果：X=（0.048 0±0.004 6）mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

該研究采用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測(cè)定魚肉罐頭中的甲基汞，對(duì)測(cè)定過程中不確定度的主要來源及各不確定分量進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果表明，不確定度主要來源是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測(cè)量重復(fù)性和提取效率，其中影響不確定度的最大因素是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，樣品稱量和定容對(duì)不確定度影響較小。

因此，在今后的檢測(cè)過程中，重點(diǎn)監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)曲線帶來的不確定度，通過選擇高純度的標(biāo)準(zhǔn)品和高精度的量器、增加測(cè)量次數(shù)、提高檢驗(yàn)人員的操作水平、注意儀器的維護(hù)保養(yǎng)使其保持較高靈敏度等措施減少測(cè)量數(shù)據(jù)的不確定性，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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