抗核抗體對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值

曹令儀　陳英杰　李仲笑

【摘要】 目的：探討間接免疫熒光法測(cè)定抗核抗體診斷鼻咽癌的可能性。方法：收集2018年6月-2019年10月江門市中心醫(yī)院收治的129例鼻咽癌，77例健康體檢標(biāo)本作為對(duì)照組，通過間接免疫熒光法檢測(cè)血清中抗核抗體。結(jié)果：抗核抗體陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌組52.9%，Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌組62.1%，對(duì)照組18.2%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=11.809，P=0.003）;Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌組與Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌組分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.972、8.015，P=0.002、0.005）;Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌組和Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.874，P=0.310）?？购丝贵w核熒光核型比較，兩組均以抗細(xì)胞核抗體為主，鼻咽癌組比對(duì)照組多了周期蛋白型、著絲點(diǎn)型和紡錘體型?？购丝贵w熒光滴度比較，滴度1∶100，鼻咽癌組46.1%，對(duì)照組78.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.003，P=0.025）;滴度1∶320，鼻咽癌組38.2%，對(duì)照組21.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=1.444，P=0.229）;滴度≥1∶1 000，鼻咽癌組15.8%，對(duì)照組無。結(jié)論：鼻咽癌患者血清的抗核抗體不同于健康者生理性自身抗體，抗核抗體對(duì)鼻咽癌的診斷提供了一定的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 抗核抗體 間接免疫熒光法 鼻咽癌

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.15.028 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2020）15-00-03

Diagnostic Value of Antinuclear Antibody in Nasopharyngeal Carcinoma/CAO Lingyi， CHEN Yingjie， LI Zhongxiao. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（15）： -67

[Abstract] Objective： To investigate the possibility of diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by antinuclear antibody indirect immunofluorescence assay. Method： A total of 129 cases of nasopharyngeal carcinoma admitted to the Jiangmen Central Hospital from June 2018 to October 2019 were collected， and 77 healthy physical examination specimens were used as the control group. Determined antinuclear antibody by indirect immunofluorescence assay. Result： The positive rates of antinuclear antibodies were 52.9% in group Ⅰ-Ⅱ nasopharyngeal carcinoma， 62.1% in group Ⅲ-Ⅳ nasopharyngeal carcinoma， and 18.2% in control group. The difference among the three groups was statistically significant （字2=11.809， P=0.003）. The difference between the Ⅰ-Ⅱ nasopharyngeal carcinoma group and the Ⅲ-Ⅳ nasopharyngealcarcinoma group and the control group was statistically significant （字2=9.972， 8.015; P=0.002， 0.005）. There was no statistical difference between the Ⅰ-Ⅱ nasopharyngeal carcinoma group and the Ⅲ-Ⅳ nasopharyngeal carcinoma group （字2=0.874， P=0.310）. The anti-nuclear antibody fluorescence titer was 1∶100， 46.1% in the nasopharyngeal carcinoma group and 78.6% in the control group， the difference was statistically significant

（字2=5.003， P=0.025）. The titer was 1∶320， 38.2% in the nasopharyngeal carcinoma group and 21.4% in the control group， the difference was not statistically significant （字2=1.444， P=0.229）. The titer was ≥1∶1 000， 15.8% in the nasopharyngeal carcinoma group， and 0 in the control group. Compared with the nuclear nucleus of antinuclear antibody， both groups were mainly anti-nuclear antibodies， and the nasopharyngeal carcinoma group had more cyclin， centromere and spindle type than the control group. Conclusion： The anti-nuclear antibodies in the serum of patients with nasopharyngeal carcinoma are different from the healthy self-antibody antibodies， and anti-nuclear antibodies provide a basis for the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Antinuclear antibody Indirect immunofluorescence Nasopharyngeal carcinoma

First-authors address： Jiangmen Central Hospital， Jiangmen 529000， China

鼻咽癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，早期（Ⅰ～Ⅱ期）鼻咽癌患者經(jīng)過治療5年生存率可以高達(dá)90%[1-2]。由于早期癥狀不典型，鼻咽解剖位置深導(dǎo)致期發(fā)病隱匿，70%患者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌時(shí)已達(dá)中晚期（Ⅲ～Ⅳ期）。中晚期鼻咽癌治療效果欠佳，5年生存率僅為40%[3]。EB病毒抗體檢測(cè)作為鼻咽癌的篩選實(shí)驗(yàn)存在較高的假陽性，敏感性和特異性有待提高[4]。CT、核磁共振、病理活檢和鼻咽內(nèi)鏡檢查等是診斷鼻咽癌的主要方法，但創(chuàng)傷損傷和高昂的費(fèi)用限制了其臨床應(yīng)用?？购丝贵w（anti-nuclear antibody，ANA）是以真核細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分為靶抗原的器官非特異性自身抗體，主要用于輔助診斷自身免疫性疾病，觀察疾病活動(dòng)度和治療反應(yīng)。近年來研究表明，ANA高頻率出現(xiàn)于惡性腫瘤不同階段的患者血液中，它是惡性腫瘤早期診斷的潛在生物標(biāo)志物[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)乳腺癌、肺癌研究表明，ANA作為腫瘤標(biāo)志物能提高腫瘤的早期檢出率[6-7]。本研究將用間接熒光法比較健康者和鼻咽癌患者血清的自身抗體，分析ANA與鼻咽癌的相關(guān)性，以探討ANA作為鼻咽癌早期診斷指標(biāo)的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

江門市中心醫(yī)院2018年6月-2018年9月收治鼻咽癌患者129例，年齡24～79歲，中位年齡51歲，男104例，女25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者必須經(jīng)病理組織活檢確診為鼻咽癌及符合鼻咽癌的臨床指征，沒有自身免疫病臨床表現(xiàn)。健康體檢者既往身體健康，無慢性疾病史，無自身免疫病臨床表現(xiàn)。按照UICC8版分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期8例，Ⅱ期23例，Ⅲ期57例，Ⅳ期41例。按照WHO鼻咽癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)（2005年版）：非角化性癌117例，角化性鱗癌12例。選擇同期健康體檢者77例對(duì)照，年齡24～76歲，中位年齡50歲，男58例，女19例。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 間接免疫熒光法檢測(cè)ANA

清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取研究對(duì)象肘靜脈血液3 ml，3 000 r/min分離血清零下20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。檢測(cè)試劑購自德國(guó)歐蒙診斷公司，嚴(yán)格按照說明操作。首次PBS稀釋液將血清按1∶100稀釋，取25 μl滴加于反應(yīng)板，將貼有生物薄片載片倒扣反應(yīng)板凹槽，室溫放置30 min。PBS沖洗載片后，PBS浸泡5 min，取出晾干。滴加20 μl熒光素標(biāo)記二抗于反應(yīng)板，重復(fù)上述步驟后封片。ZISS熒光顯微鏡判讀結(jié)果，以抗體滴度≥100為陽性。陽性標(biāo)本者進(jìn)一步1∶320和1∶1 000稀釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。組間的百分率比較用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P<0.05，三組進(jìn)行兩兩比較時(shí)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05/3=0.017。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和鼻咽癌Ⅰ～Ⅱ期組、Ⅲ～Ⅳ期組ANA的結(jié)果

77例體檢對(duì)照組檢出ANA陽性14例，陽性率18.2%;34例Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌患者組檢出ANA陽性18例，陽性率52.9%;95例Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者組檢出ANA陽性59例，陽性率62.1%，三組的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=11.809，P=0.003）。與對(duì)照組比，Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ期組的陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.972、8.015，P=0.002、0.005）。Ⅰ～Ⅱ期組與Ⅲ～Ⅳ期組比，陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.874，P=0.310），見表1。

2.2 對(duì)照組和鼻咽癌組的ANA的結(jié)果及熒光模式

對(duì)照組和鼻咽癌患者組ANA比較，陽性率分別為18.2%和58.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=32.51，P=0.00）。鼻咽癌患者組7種熒光模式陽性，對(duì)照組只有4種熒光模式陽性，鼻咽癌組熒光模式更加豐富，見表2。

2.3 對(duì)照組和鼻咽癌組ANA陽性標(biāo)本熒光滴度比較

ANA陽性標(biāo)本，滴度1∶100，對(duì)照組陽性率78.6%，鼻咽癌組陽性率46.1%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.003，P=0.025）;滴度1∶320，對(duì)照組陽性率21.4%，鼻咽癌組陽性率38.2%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=1.444，P=0.229）;滴度1∶1 000，對(duì)照組未檢出，鼻咽癌組陽性率15.8%。對(duì)照組以低滴度1∶100為主，鼻咽癌組各個(gè)滴度都有分布，以中低滴度為主，見表3。

2.4 對(duì)照組和鼻咽癌患者組ANA陽性標(biāo)本在細(xì)胞內(nèi)定位比較

ANA陽性標(biāo)本中，對(duì)照組和鼻咽癌患者組在細(xì)胞內(nèi)均以抗細(xì)胞核抗體為主，占71.5%和72.4%，兩組間抗細(xì)胞核抗體和抗細(xì)胞漿抗體的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.233、0.082;P=0.630、0.775）。鼻咽癌組抗細(xì)胞分裂期蛋白抗體占抗核抗體陽性2.6%，對(duì)照組未檢出，見表4。

3 討論

早期診斷是治療鼻咽癌，降低死亡率，提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。目前，臨床上以檢測(cè)EB病毒抗體篩選早期鼻咽癌。但超過90%的人曾經(jīng)感染EB病毒，部分正常的人體內(nèi)存在潛伏感染狀態(tài)的EB病毒。EB病毒感染存在于傳染性單核細(xì)胞增多癥等多種疾病。部分鼻咽癌患者EB病毒感染陰性。尋找新的血清標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合EB病毒抗體診斷早期鼻咽癌是當(dāng)今腫瘤研究的熱門[8]。腫瘤在發(fā)生發(fā)展的過程中，惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞過量表達(dá)正常的成分、合成新的成分或者對(duì)自體蛋白翻譯后俢飾、錯(cuò)誤折疊產(chǎn)生腫瘤相抗原。腫瘤相抗原已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床輔助診斷腫瘤。腫瘤早期，腫瘤相抗原濃度低，在血液存在時(shí)間短或集中的局部不能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，常規(guī)方法難以檢測(cè)。腫瘤抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體[9]，自身抗體的產(chǎn)生放大了檢測(cè)的生物信號(hào)，在腫瘤產(chǎn)生的早期就達(dá)到抗體檢測(cè)的血清水平。自身抗體能夠穩(wěn)定地存在循環(huán)血液中，便于收集檢測(cè)。自身抗體出現(xiàn)在臨床癥狀前數(shù)月甚至數(shù)年的患者血液中，而且易于檢測(cè)。相對(duì)于低濃度的腫瘤相關(guān)抗原，自身抗體能夠更早輔助診斷惡性腫瘤[10-11]。自身抗體是診斷早期腫瘤十分有前景的腫瘤標(biāo)志物。

間接免疫熒光法檢測(cè)ANA是臨床檢查自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的推薦方法[12]。本研究中，鼻咽癌組患者ANA陽性率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示患者體內(nèi)存在針對(duì)鼻咽癌組織的自身抗體，和童永清[13]研究相符。對(duì)照組ANA以1∶100低滴度為主，鼻咽癌患者組以1∶100和1∶320中低滴度為主，還有一部分對(duì)照組未檢出的1∶1 000高滴度。咽癌組患者組和對(duì)照組都是以抗細(xì)胞核抗體為主，熒光模式比健康者豐富。Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ期患者陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ANA與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系不大。生理狀態(tài)下，健康者能產(chǎn)生少量自身抗體，建立獨(dú)特性和抗獨(dú)特性網(wǎng)絡(luò)，抑制自身免疫的出現(xiàn)發(fā)揮生理調(diào)節(jié)的作用。少部分健康者血清能檢出低滴度的自身抗體。鼻咽癌腫瘤細(xì)胞惡變產(chǎn)生了新的蛋白質(zhì)，或者某些蛋白質(zhì)被過度表達(dá)，從而引起免疫應(yīng)答產(chǎn)生自身抗體。腫瘤抗原的自身抗體增加了患者血清的陽性率，提高免疫熒光的滴度。鼻咽癌是一個(gè)多因素、多階段、多基因參與的惡性腫瘤。腫瘤細(xì)胞惡變形成不同的腫瘤抗原，經(jīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)生不同的自身抗體。鼻咽癌患者血清比健康者有更多不同種類的自身抗體，在ANA檢測(cè)中顯現(xiàn)更多的熒光核型。比較對(duì)照組和鼻咽癌患者組ANA分布的細(xì)胞定位和熒光模型，兩組均以抗細(xì)胞核抗體為主。周期蛋白型、著絲點(diǎn)型和紡錘體型的熒光模式只出現(xiàn)在患者血清中，核仁型也比對(duì)照組高。前三種熒光核型自身抗體對(duì)應(yīng)的靶抗原都是細(xì)胞有絲分裂分裂期出現(xiàn)的蛋白質(zhì)[14]。核仁含有豐富的核糖體蛋白，與細(xì)胞增殖生長(zhǎng)密切相關(guān)。核仁型行對(duì)應(yīng)的靶抗原可能是某些與細(xì)胞增殖或生物合成有關(guān)的蛋白質(zhì)。這提示了鼻咽癌患者體內(nèi)ANA相應(yīng)的靶抗原可能是某些與細(xì)胞分裂或細(xì)胞內(nèi)生物合成有關(guān)的蛋白質(zhì)。這就為ANA早期診斷鼻咽癌，甚至治療鼻咽癌提供了理論上的可能性。

間接免疫熒光法檢測(cè)ANA能對(duì)靶抗原所在的細(xì)胞成分進(jìn)行熒光染色，顯現(xiàn)出特征性的熒光模式。熒光模式初步區(qū)分不同的ANA，但不能確認(rèn)靶抗原的本質(zhì)。利用蛋白質(zhì)微陣列，血清學(xué)篩選cDNA表達(dá)文庫等技術(shù)[15-16]分析特征性熒光核型，明確其靶抗原的本質(zhì)。研究靶抗原在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為鼻咽癌的診斷與治療提供理論支持。篩選靶抗原對(duì)應(yīng)的自身抗體，尋找對(duì)鼻咽癌特異性的自身抗體或自身抗體譜以補(bǔ)充或者驗(yàn)證ANA對(duì)鼻咽癌的早期診斷。

綜上所述，鼻咽癌患者和健康者ANA的差異為鼻咽癌的早期診斷提供了一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2019-02-03） （本文編輯：張亮亮）