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    基因芯片技術(shù)在自然流產(chǎn)胚胎染色體分析中的應(yīng)用

    2020-07-14 00:41:52余勤儉孫素玉沈旭娜徐雪琴唐少華周媛萍
    健康研究 2020年3期
    關(guān)鍵詞:基因芯片核型三體

    余勤儉,孫素玉,沈旭娜,徐雪琴,唐少華,周媛萍

    (1. 溫州市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科,浙江 溫州 325000;2.湖州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科,浙江 湖州313000)

    造成自然流產(chǎn)的原因眾多,有研究[1]表明,超過50%的自然流產(chǎn)是由胚胎染色體異常引起。目前臨床對胚胎染色體分析的金標(biāo)準(zhǔn)為染色體核型分析技術(shù),但染色體核型分析技術(shù)診斷周期長且易受標(biāo)本陳舊、污染等多種因素影響。基因芯片單核苷酸多態(tài)性陣列(single nucleotide polymorphism array,SNP-array)是含有大量SNP位點(diǎn)序列的高密度基因芯片,由原位合成在硅材料上的大量特定寡聚核苷酸(探針)組成,將待測核酸樣本處理后與芯片上的探針按照堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交。采用激光共聚焦掃描經(jīng)染色、信號放大處理后的雜交芯片采集熒光信號,對每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)字化分析,判斷對應(yīng)片段或位點(diǎn)是否有擴(kuò)增或缺失,可實(shí)現(xiàn)核酸分子高通量檢測和分析[2]。Affymetrix公司基因芯片對人類基因組的分布密度為1 marker/4 kb,芯片包含550 000 CNV標(biāo)記及200 000 SNP標(biāo)記。本研究采用Affymetrix公司基因芯片技術(shù)對自然流產(chǎn)患者胚胎組織進(jìn)行全基因組染色體檢測,旨在探討該基因芯片技術(shù)在臨床染色體分析中的應(yīng)用價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2015年1月—2017年6月溫州市中心醫(yī)院收治的70例早期自然流產(chǎn)患者為研究對象,所選患者均經(jīng)B超檢測胚胎停止發(fā)育或胎心、胎芽消失。所選患者年齡21~42歲,平均(31.0±3.6) 歲;孕周7~12周,平均(9.2±0.9) 周;孕次1~3次,平均(1.7±0.6) 次。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

    1.2 基因芯片檢測 無菌條件下,采用DNA提取試劑盒(QIAGEN 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒,美國QIAGEN公司)提取流產(chǎn)胚胎組織基因組DNA,按照試劑盒說明書步驟提取。采用Affymetrix公司的基因芯片(Affymertrix GeneChip 750K SNP)進(jìn)行全基因組染色體檢測,操作方法:提取的基因組DNA溶解于AE 緩沖液,調(diào)整濃度至50 ng/μL,用Nsp I限制內(nèi)切酶進(jìn)行處理。運(yùn)用T4連接酶將Nsp I接頭連接至Nsp I酶切產(chǎn)物上,然后以Nsp I酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1份Nsp I酶切產(chǎn)物做4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增片段為150~2 000 bp。擴(kuò)增的4份PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠法混合純化后,用52 μL洗脫液進(jìn)行洗脫。取2 μL進(jìn)行濃度測定,45 μL加入5 μL稀釋的片段化試劑進(jìn)行PCR片段化程度,片段化產(chǎn)物在25~125 bp內(nèi)。片段化產(chǎn)物在脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后,置入芯片與混合純化液進(jìn)行雜交變性,雜交時(shí)間為16~18 h,溫度50℃。雜交完成后將芯片進(jìn)行洗滌、染色,最后進(jìn)行芯片掃描。

    1.3 數(shù)據(jù)分析 采用Affymetrix公司研發(fā)的染色體分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,染色體異常包括染色體數(shù)目異常以及結(jié)構(gòu)異常。數(shù)目異常主要為非整倍體以及多倍體,結(jié)構(gòu)異常為染色體拷貝數(shù)目變異(CNV),CNV判斷標(biāo)準(zhǔn)為缺失片段大于400 kb,重復(fù)片段大于1 Mb[3]。

    1.4 臨床評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用美國醫(yī)學(xué)遺傳協(xié)會(huì)制定的CNV診斷專業(yè)指南[4]進(jìn)行CNV結(jié)果的臨床評價(jià)。①良性CNV指在多個(gè)已有的文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫資料中均報(bào)道為良性變異;②致病CNV指在既往相關(guān)文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)明確為致病變異;③致病意義不明CNV指在報(bào)告時(shí)無法找出明確證據(jù)來明確檢測到的CNV 的臨床意義,或所檢測到的CNV不符合報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 染色體異常情況 基因芯片技術(shù)檢測70例早期自然流產(chǎn)胚胎組織基因,21例正常,49例異常,異常檢出率為70.0%。49例異常中38例為染色體數(shù)目異常,11例為染色體結(jié)構(gòu)異常。

    2.2 染色體數(shù)目異常 38例染色體數(shù)目異常中,三倍體4例,非整倍體34例。6例染色單體(45, XO),2例2-三體,2例3-三體,2例4-三體,1例7-三體,1例8-三體,1例15-三體,10例16-三體,1例17-三體,1例18-三體,3例21-三體,2例22-三體,1例48,XX,+7,+21,1例50,XX,+13,+18,+19,+21。

    2.3 染色體結(jié)構(gòu)異常 11例染色體結(jié)構(gòu)異常中,1條染色體異常為微缺失或微重復(fù)有10例,染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜異常即多條染色體結(jié)構(gòu)改變1例。具體染色體核型見表1。

    表1 染色體結(jié)構(gòu)異常及核型

    3 討論

    超過35歲且有過流產(chǎn)史女性中,染色體異常導(dǎo)致流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)75%以上[5-6]。本研究中70例自然流產(chǎn)的染色體異常率為70.0%。本研究中,染色體異常主要包括染色體多倍體、單體、三體以及染色體結(jié)構(gòu)異常等,38例染色體數(shù)目異常中,三倍體4例,非整倍體34例,其中染色單體(45, XO)6例,與既往研究[7]結(jié)果相符合。11例染色體結(jié)構(gòu)異常中,10例出現(xiàn)微缺失或微重復(fù),1例為染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜異常。查閱11例結(jié)構(gòu)異常染色體所對應(yīng)的核型,發(fā)現(xiàn)部分染色體拷貝數(shù)目變異與身材矮小、發(fā)育遲緩、智力障礙以及器官畸形等有關(guān),是否與自然流產(chǎn)有關(guān)還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究;部分染色體拷貝數(shù)目變異顯示為致病意義不明,需對其父母的染色體進(jìn)行檢測,判斷是否與雙親遺傳有關(guān)[8-9],如遺傳自父母,大部分為良性多態(tài)性改變;如為突變,可能為存在臨床意義的CNV[10-11]。

    流產(chǎn)遺傳學(xué)檢測結(jié)果不僅可解釋該次流產(chǎn)的具體原因,同時(shí)可為下次妊娠提供具體建議[12-13]。如檢測結(jié)果為非整倍體,則大多為偶發(fā)性,下次妊娠選擇合適的產(chǎn)前診斷可獲得良好預(yù)后;若為正常染色體或染色體多態(tài)性導(dǎo)致的流產(chǎn),則需找尋其他原因;若為致病意義不明確的染色體拷貝異常,則需檢測是否為雙親遺傳等?;蛐酒夹g(shù)運(yùn)用于流產(chǎn)胚胎及胎兒染色體檢測具有如下優(yōu)勢[14-15]:①分辨率高,可檢出小于5 Mb的CNV;②準(zhǔn)確性高,可避免培養(yǎng)中出現(xiàn)染色體突變以及母體細(xì)胞選擇性生長等情況;③檢出率高;④檢測速度快?;蛐酒夹g(shù)也存在著不足,如基因芯片技術(shù)無法檢測染色體的插入、倒位、平衡易位以及低比例嵌合,對致病意義不明的染色體拷貝異常無法明確其臨床意義[16-17]。本研究11例染色體結(jié)構(gòu)異常中,一條染色體異常為微缺失或微重復(fù)有10例,小于5 Mb的CNV有6例,最小的為1.04 Mb,優(yōu)于傳統(tǒng)核型分析技術(shù)水平。

    綜上,基因芯片技術(shù)對自然流產(chǎn)患者胚胎組織的全基因組染色體分析具有準(zhǔn)確性高、檢出率高的特點(diǎn),在流產(chǎn)病因解釋、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、再次生育指導(dǎo)等方面具有臨床應(yīng)用的價(jià)值。

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