四溴雙酚A誘導(dǎo)大鼠肝臟氧化損傷機(jī)制的研究

何建波, 張杭君

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前使用較為廣泛的典型溴化阻燃劑，是一種持久性環(huán)境污染物[1]。近幾十年的研究[2]顯示，TBBPA已在河流、水生生物甚至人體血液中檢出。在日本大阪的水生動物中，魚類體內(nèi)和貝類動物體內(nèi)TBBPA的濃度分別達(dá)到0.8 μg/kg·ww和4.6 μg/kg·ww。英國海域的海豚脂肪樣品檢測結(jié)果顯示TBBPA的濃度范圍為6～35 ng/kg·ww[3]。在美國波士頓的婦女母乳樣品中，35%的樣品檢測到了TBBPA，濃度范圍為0～11 ng/g·fat[4]。挪威某一電子拆解廠電子拆解工人血漿中的TBBPA濃度要高于實(shí)驗(yàn)室人員[5]。近年來，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)對TBBPA的毒性進(jìn)行了評估[6]，因具有致癌作用，TBBPA已被列入2A類致癌物。TBBPA在環(huán)境中廣泛存在，動物和人類可通過呼吸吸入、皮膚接觸和攝入等途徑接觸到TBBPA，這對環(huán)境中的動物和人類的健康造成巨大威脅[7]。

目前，大量的研究主要關(guān)注TBBPA對水生動物的影響，對哺乳動物的影響研究較少，尤其是對哺乳動物肝臟的損傷及其作用機(jī)制還尚未闡明。已有研究[8]發(fā)現(xiàn)，溴代阻燃劑容易在肝臟中富集。鯽魚暴露于TBBPA 12周后發(fā)現(xiàn)，TBBPA能夠引起鯽魚肝臟中脂質(zhì)積累、肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞間隙增大等現(xiàn)象[9]。Wikoff等[10]認(rèn)為TBBPA在魚體產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與氧化應(yīng)激有關(guān)。TBBPA暴露可導(dǎo)致幼齡卿魚抗氧化系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力的降低，還原型谷胱甘肽(GSH)水平呈時(shí)間和劑量依賴性下降，造成機(jī)體氧化應(yīng)激[6]。黑斑蛙暴露于TBBPA后，精巢組織出現(xiàn)空泡、生精細(xì)胞排列紊亂、生精細(xì)胞不同程度的分散脫落等明顯病變；同時(shí)，黑斑蛙精巢組織中的總超氧化物岐化酶(T-SOD)，GSH-PX活性降低，GSH含量明顯降低，表明TBBPA暴露擾亂了黑斑蛙抗氧化系統(tǒng)[11]。本文以TBBPA為目標(biāo)污染物，以雄性SD大鼠為研究對象，采用體內(nèi)暴露方法研究TBBPA對雄性SD大鼠肝臟損傷的效應(yīng)及其作用機(jī)制，為阻燃劑的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 選取42只7周齡Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量為(222.2±2.5)g，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物飼育室：環(huán)境光照周期為12 h光照和12 h黑暗，溫度為(23±2)℃，濕度為(50±10)%，自由飲食。正式試驗(yàn)前飼養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)程序均按照杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器 TBBPA(tetrabromobisphenol A，化學(xué)式：C15H12Br4O2，純度>98%，CAS：79-94-7)標(biāo)準(zhǔn)品和玉米油(CAS：8001-30-7)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，活性氧(ROS)、SOD、GSH和GSH-Px檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。超薄切片機(jī)(Leica EM UC7)、烘片機(jī)(Leica HI 1220)和石蠟切片機(jī)(Leica RM 2235)均購自德國徠卡公司，透射光顯微鏡(Olympus BX 51)購自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Multiskan FC)購自美國Thermo公司，高度冷凍離心機(jī)(KDC-140 HR)購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 大鼠飼養(yǎng)與暴露 將42只SD大鼠隨機(jī)分為4個處理組: 0、10、100、1 000 mg/kg；2個恢復(fù)組: 0(R)mg/kg(空白恢復(fù)組)、1 000(R)mg/kg(1 000 mg/kg劑量恢復(fù)組)，每組7只。給藥時(shí)，將TBBPA溶解于食用玉米油中，保存于冷藏條件下(約4℃)，每周更換1次，保證給藥溶液穩(wěn)定性。每天上午9時(shí)對各組大鼠進(jìn)行灌胃，對照組給予等量玉米油，連續(xù)灌胃35 d。暴露結(jié)束后，4個處理組進(jìn)行解剖采樣。2個恢復(fù)組停止灌胃，正常進(jìn)食，自然恢復(fù)1周后進(jìn)行解剖采樣。每日準(zhǔn)確記錄體重，觀察大鼠的生長發(fā)育情況。

1.4 大鼠肝臟組織樣品采集 最后一次灌胃24 h后稱重，4個處理組進(jìn)行解剖采樣，靜脈注射0.5 mL70%乙醇使大鼠死亡后立即解剖。取出各器官組織，用濾紙吸干血水后準(zhǔn)確稱重。2個恢復(fù)組的大鼠自然恢復(fù)1周后進(jìn)行解剖采樣。肝臟系數(shù)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%

1.5 HE染色與觀察 取各組新鮮肝臟組織樣本1份，經(jīng)中性緩沖液福爾馬林(pH 7.4)固定12～24 h，用水沖洗30 min后脫水。用75%～100%乙醇梯度脫水后，放入85%、95%及100%二甲苯中透明。經(jīng)過浸蠟、包埋后進(jìn)行切片。切片厚度3 μm，然后經(jīng)過脫蠟、HE染色、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照(×100)，分析最大截面，觀察肝臟組織形態(tài)。

1.6 活性氧與抗氧化相關(guān)指標(biāo)檢測 SOD測定(羥胺法)：按試劑盒說明書應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的SOD活力，用U/mg蛋白表示；ROS測定(化學(xué)熒光法)：按試劑盒說明書應(yīng)用DCFH-DA法測定樣品中的ROS活性，用熒光度量/毫克蛋白表示；GSH-Px測定：按試劑盒說明書應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的GSH-Px活力，用μmol/g蛋白表示；GSH測定：按試劑盒說明書應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的GSH含量，用μmol/g蛋白表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7.00和 SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟的影響 連續(xù)灌胃35 d后，與0 mg/kg組比較，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組的大鼠平均體增重均降低；其中1 000 mg/kg處理組大鼠的平均體增重[(142.7±24.8) g]比0 mg/kg組[(218.5±33.3) g]減少了34.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見封三圖1A。連續(xù)灌胃35 d后，各劑量組大鼠的平均肝臟重與0 mg/kg組比較未表現(xiàn)出明顯差異，見封三圖2B。經(jīng)過1周自然恢復(fù)后，1 000 (R) mg/kg組平均肝臟重[(13.9±1.7) g]比1 000 mg/kg組[(12.2±1.5) g]增長了13.9%，平均體增重比1 000 mg/kg組增長了29.2%。如封三圖1C所示，連續(xù)灌胃35 d后，TBBPA對大鼠的肝臟系數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義影響。

2.2 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃35 d后，0 mg/kg 組肝臟組織形態(tài)正常(封三圖2A)；10 mg/kg組經(jīng)四溴雙酚A暴露后，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)部分空泡(封三圖2B，黑色箭頭)；100 mg/kg組細(xì)胞空泡化現(xiàn)象明顯，并伴有細(xì)胞邊界模糊現(xiàn)象(封三圖2C，黑色箭頭)；1 000 mg/kg組出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象的肝細(xì)胞數(shù)量相對較少(封三圖2D，黑色箭頭)，但細(xì)胞膜邊界模糊現(xiàn)象加重且細(xì)胞間隙增大。與1 000 mg/kg組比較，1 000(R)mg/kg組經(jīng)1周恢復(fù)后，細(xì)胞空泡現(xiàn)象減少，肝細(xì)胞組織損傷有所減輕，與0(R)mg/kg組(封三圖2E)相比，1 000(R)mg/kg組仍存在一定程度的形態(tài)學(xué)變化(封三圖2F)。

2.3 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟ROS含量的影響 如圖1所示，與0 mg/kg 組ROS含量[(84.3±18.5 )熒光度量/毫克蛋白]相比，經(jīng)過TBBPA暴露35 d后，10 mg/kg組[(59.5±11.5) 熒光度量/毫克蛋白]、100 mg/kg組[(47.0±7.6) 熒光度量/毫克蛋白]、1 000 mg/kg組[(46.4±7.5) 熒光度量/毫克蛋白]的大鼠肝臟中ROS含量分別降低了29.4%、44.2%、45.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；謴?fù)1周后，1 000(R)mg/kg組的ROS水平[(73.2±9.2 )熒光度量/毫克蛋白]比1 000 mg/kg組升高了57.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P<0.01；##與1 000 mg/kg組比較，P<0.01。圖1 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟ROS水平的變化

2.4 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟中T-SOD的影響 如圖2所示，連續(xù)灌胃35 d后，與0 mg/kg 組相比，10 mg/kg組、100 mg/kg組T-SOD的活性升高； 1 000 mg/kg組大鼠肝臟T-SOD活性略低于10 mg/kg組和100 mg/kg組。自然恢復(fù)1周后，1 000(R)mg/kg組的T-SOD含量比1 000 mg/kg組降低12.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

#與1 000 mg/kg組比較，P<0.05。圖2 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟T-SOD活性的變化

2.5 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟GSH含量的影響 如圖3所示，與0 mg/kg 組相比，在TBBPA連續(xù)暴露35 d后，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組大鼠肝臟組織中的GSH含量隨著TBBPA濃度的上升逐漸上升；100 mg/kg組、1 000 mg/kg組的大鼠肝臟GSH含量分別比0 mg/kg 組上升了8.6%、27.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1周自然恢復(fù)后，1 000(R)mg/kg組的GSH含量比1 000 mg/kg組降低了23.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P <0.01；##與1 000 mg/kg組比較，P <0.01。圖3 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟GSH含量的變化

2.6 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟中GSH-Px活性的影響 如圖4所示，與0 mg/kg 組[(73.7±17.2 )μmol/g蛋白]相比，在TBBPA連續(xù)暴露35 d后，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組大鼠肝臟組織中的GSH-Px活性隨著TBBPA濃度的上升逐漸上升；1 000 mg/kg組的大鼠肝臟GSH-Px活性[(106.5±12.83) μmol/g蛋白]比0 mg/kg 組上升了44.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1周自然恢復(fù)后，1 000(R)mg/kg組的GSH-Px活性與1 000 mg/kg組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P<0.01。圖4 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟GSH-Px含量的變化

3 討論

有研究[12]證實(shí)，TBBPA對水生生物的生存、繁殖和生長發(fā)育有一定的危害。斑馬魚暴露于TBBPA會導(dǎo)致產(chǎn)卵量和幼魚存活率下降[13]。也有報(bào)道[14]稱，TBBPA會干擾斑馬魚胚胎幼體的發(fā)育。研究[15]顯示，TBBPA暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎孵化率、存活率降低，胚胎畸形率增加。也有研究[16]發(fā)現(xiàn)，TBBPA 會抑制蝌蚪尾巴的發(fā)育。250 μg/L TBBPA暴露可抑制黑斑蛙蝌蚪的生長發(fā)育[11]。本研究結(jié)果顯示，1 000 mg/kg TBBPA體內(nèi)灌胃可導(dǎo)致大鼠體增重明顯下降，與正常組大鼠體增重相比降低了34.7%，對大鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。先前的研究[17]顯示，長期低劑量暴露于雙酚A(BPA)的大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)并未受到影響。100 mg/kg BPA染毒6周對大鼠體質(zhì)量無明顯影響[18]，200 mg/kg劑量BPA暴露會導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量增長緩慢[19]，提示TBBPA對大鼠生長發(fā)育的影響要強(qiáng)于化學(xué)結(jié)構(gòu)更簡單的BPA。

大量生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)研究[20]報(bào)道，環(huán)境中廣泛存在的阻燃劑能夠?qū)游矬w造成病理性的損傷。接觸溴化阻燃劑異氰脲酸酯，能引起小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)受損[21]。有機(jī)磷酸酯阻燃劑暴露可造成斑馬魚肝臟細(xì)胞腫脹，細(xì)胞邊界模糊等[22]。黑斑蛙接觸全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)會導(dǎo)致肝臟細(xì)胞出現(xiàn)邊界模糊及空泡化現(xiàn)象[23]。有研究[11]顯示，TBBPA可造成黑斑蛙精巢組織損傷，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡等病理學(xué)特性。TBBPA可在小鼠肝臟內(nèi)蓄積，對小鼠肝臟造成潛在危害[24]。本研究結(jié)果顯示，暴露于TBBPA后，大鼠肝臟組織學(xué)出現(xiàn)病理性損傷，包括肝細(xì)胞腫脹、細(xì)胞空泡化及細(xì)胞膜邊界模糊等現(xiàn)象；隨著TBBPA暴露濃度的升高，大鼠肝臟組織損傷更為明顯。Ronn等[25]的研究結(jié)果顯示，短期高濃度(250 mg/kg)BPA暴露會造成Fischer 344大鼠肝臟氧化損傷，這與本研究結(jié)果一致，提示高濃度的阻燃劑對哺乳動物肝臟具有一定損傷作用。

細(xì)胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)是機(jī)體正常代謝的保障[26]。在正常情況下，過量的ROS和其他促氧化劑可由抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)抗氧化酶分解，以維持生物體內(nèi)氧化抗氧化的平衡[27]。有研究[28-29]報(bào)道，化學(xué)試劑等危險(xiǎn)因素可能破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，進(jìn)一步造成機(jī)體損傷。研究[30]顯示，TBBPA暴露可誘導(dǎo)魚類抗氧化系統(tǒng)失衡，最終造成精子質(zhì)量下降。TBBPA引起的靶器官毒性作用可能是通過誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)紊亂造成的。機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)通常會通過響應(yīng)ROS的變化來調(diào)節(jié)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。有研究[11]顯示，黑斑蛙暴露于TBBPA后，ROS水平降低，造成黑斑蛙精巢中抗氧化系統(tǒng)的失衡，最終導(dǎo)致精細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。本研究結(jié)果顯示，TBBPA可造成大鼠肝臟中ROS水平異常，1 000(R)mg/kg組的ROS水平比1 000 mg/kg組升高了57.8%，與 0(R)mg/kg組水平接近；有報(bào)道[31]顯示，BPA可造成氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致大鼠肝臟組織氧化性損傷；提示TBBPA通過影響大鼠肝臟ROS水平破壞氧化還原平衡而肝臟造成氧化損傷。

SOD、GSH-Px活性與GSH含量是反應(yīng)機(jī)體健康的重要指標(biāo)。SOD可通過歧化反應(yīng)消除超氧陰離子自由基，生成過氧化氫[32]，對機(jī)體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)平衡起重要作用，可保護(hù)細(xì)胞免受損傷。當(dāng)蚯蚓受到輕度環(huán)境脅迫時(shí), 體內(nèi)SOD酶活性會有所提高, 而當(dāng)受到重度逆境脅迫時(shí), SOD酶活性通常下降[33-34]。有研究[19]表明，隨著BPA劑量的升高，SOD水平會有一定程度的降低，可能與高劑量時(shí)GSH-Px無法代償性增加有關(guān)，這與本研究結(jié)果一致，表明在高劑量下，TBBPA可能會對大鼠體內(nèi)存在的SOD酶活性產(chǎn)生影響，使大鼠對氧化脅迫的能力降低[35]，減弱大鼠清除氧自由基的能力。GSH可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化損傷，提供最佳的氧化還原環(huán)境，使細(xì)胞內(nèi)蛋白功能正常進(jìn)行。研究[24]表明，Wistar大鼠暴露于TBBPA 28 d后，可導(dǎo)致大鼠GSH含量上升，產(chǎn)生肝毒性效應(yīng)。Zieminska等[36]研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，TBBPA濃度與GSH呈劑量依賴效應(yīng)，表明TBBPA會引起GSH水平異常。GSH-Px是機(jī)體中重要的抗氧化酶, 是自由基清除系統(tǒng)的重要組成成分。研究[37]表明，暴露于BPA下的大鼠GSH-Px活性升高，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，隨著TBBPA濃度的增加，抗氧化酶GSH-Px活性也隨之增加，可能導(dǎo)致氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，最終導(dǎo)致氧化損傷。

綜上所述，1 000 mg/kg TBBPA體內(nèi)暴露可抑制SD大鼠的生長，大鼠肝臟組織出現(xiàn)病理學(xué)損傷。通過對肝臟中SOD、ROS、GSH和GSH-Px活性的影響，TBBPA破環(huán)大鼠肝臟中氧化還原系統(tǒng)的平衡，最終造成肝臟的氧化損傷效應(yīng)，進(jìn)而抑制其生長發(fā)育。本研究可為四溴雙酚A生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供理論依據(jù)。