基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析RACK1在糖尿病腎小管病中的表達(dá)

馮 婕,孔冉冉,解立怡,余曉洋,劉 超

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸外科;*通訊作者,E-mail:619386343@qq.com)

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎衰竭的首要原因,但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。近年來許多新的證據(jù)提示糖尿病腎小管病是糖尿病腎病的啟動(dòng)者,參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[1,2]。RACK1(GNB2L1)是WD40重復(fù)蛋白家族中一員,被報(bào)道參與數(shù)種疾病的進(jìn)展,其在糖尿病腎小管病中的作用卻少有人研究。本文擬以GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),探討活化的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1,RACK1)在糖尿病腎小管病中的表達(dá)及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析糖尿病腎病腎小管中RACK1的表達(dá)水平

在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索糖尿病腎病,得到數(shù)據(jù)系列(GSE30528),該數(shù)據(jù)來自于人類的糖尿病腎病和正常的腎臟組織(手術(shù)切除腎臟后,取正常腎組織),利用纖維微切割技術(shù)獲取腎小管,基于Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array,得到基因表達(dá)數(shù)據(jù)。在此數(shù)據(jù)系列中,分析RACK1在糖尿病腎小管及正常對(duì)照組的腎小管中的表達(dá)情況。

1.2 KEGG中搜索RACK1參與的信號(hào)通路

從KEGG(http://www.genome.jp/kegg)中尋找RACK1參與的可能通路,以及與糖尿病腎小管病的可能關(guān)系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和靶基因的測(cè)定

HK-2購(gòu)自于美國(guó)American Type Cell Collection(ATCC,Manassas,VA)。HK-2細(xì)胞被置于加有5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中,其中糖濃度為5.5 mmol/L,放置在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將其分為對(duì)照組、甘露醇組及高糖組。HK-2細(xì)胞被接種于6孔板中,24 h后約70%融合,用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,無刺激HK-2細(xì)胞作為對(duì)照組,甘露醇組加入甘露醇30 mmol/L,高糖組加入D-glucose 30 mmol/L,共刺激48 h。

Trizol提取HK-2細(xì)胞總的RNA。SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再利用ABI-Prism 7500行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。人的RACK1下游通路相關(guān)基因引物見表1。循環(huán)條件如下:預(yù)變性95 ℃ 15 min,59 ℃ 30 min,35個(gè)循環(huán),延伸溫度72 ℃ 10 min。β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCt方法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)。

表1 qRT-PCR的引物序列

Table 1 The primer sequences of qRT-PCR

基因上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) RACK1TTC TCC TCT GAC AAC CGG CAGCC ATC CTT GCC TCC AGA ASTAT1CAC AAG GTG GCA GGA TGT CTTCC CCG ACT GAG CCT GAT TASTAT3CTG CCC CAT ACC TGA AGA CCTCC TCA CAT GGG GGA GGT AGβ-actinGGC AAA TTC AAC GGC ACA GTCGCT GAC AAT CTT GAG TGA GTT

1.4 糖尿病腎病動(dòng)物模型構(gòu)建、相關(guān)指標(biāo)測(cè)定和組織學(xué)變化

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 SPF級(jí)雄性FVB/N小鼠12只,8周齡,25-30 g購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。

1.4.2 糖尿病動(dòng)物模型的建立 12只雄性FVB/N隨機(jī)分為2組:糖尿病腎病組和對(duì)照組,每組6只,稱重,測(cè)基礎(chǔ)血糖。糖尿病腎病組小鼠禁食4-6 h后,給予0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)+STZ(50 mg/kg),腹腔注射,連續(xù)5 d;對(duì)照組給予同等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2周后取尾靜脈血測(cè)血糖,血糖>16.67 mmol/L,糖尿病造模成功。

1.4.3 標(biāo)本收集 每2周測(cè)體質(zhì)量、血糖,留取尿液,ELSIA法測(cè)尿白蛋白/肌酐比(ACR)。12周后將老鼠放入代謝籠,收集24 h尿液測(cè)24 h尿蛋白定量。而后處死小鼠,一側(cè)腎臟-80 ℃凍存?zhèn)溆?切取部分組織提取RNA,行實(shí)時(shí)定量PCR;一側(cè)腎臟4%多聚甲醛固定,其中一半石蠟包埋,連續(xù)切片,行PAS染色,一半OCT包埋,-80 ℃保存,行免疫熒光染色。兔抗phospho-STAT1(p-STAT1)和兔抗phospho-STAT3(p-STAT3)購(gòu)買于Cell Signaling公司;羊抗兔熒光二抗Alexa FluorTM488購(gòu)買于Invitrogen公司;DAPI購(gòu)買于Invitrogen公司。

1.4.4 腎組織RNA的提取及測(cè)定 Trizol提取腎組織塊中的總RNA SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再利用ABI-Prism 7500行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。鼠的相關(guān)基因引物見表2。循環(huán)條件如下:預(yù)變性95 ℃ 15 min,59 ℃ 30 min,35個(gè)循環(huán),延伸72 ℃ 10 min。GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt方法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)。

表2 qRT-PCR的引物序列

Table 2 The primer sequences of qRT-PCR

基因上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) RACK1GTC TGC AAG TAC ACG GTC CAAAC AGA GTC TGG CCA TCA GCSTAT1GAT CGC TTG CCC AAC TCT TGCGA GAC ATC ATA GGC AGC GTSTAT3CCC CGT ACC TGA AGA CCA AGTCC TCA CAT GGG GGA GGT AGGAPDHGCC ATC AAC GAC CCC TTC ATATG ATG ACC CGT TTG GCT CC

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)糖尿病腎病中RACK1(GNB2L1)的表達(dá)

GEO數(shù)據(jù)分析示與對(duì)照組比較,糖尿病腎病組腎小管中RACK1(GNB2L1)表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

2.2 RACK1參與的信號(hào)通路

利用KEGG,搜索RACK1參與的信號(hào)通路,可見其通過磷酸化STAT1,激活Jak-STAT通路,進(jìn)一步作用于DNA,引起損傷(見圖2)。

與對(duì)照組相比，**P<0.01圖1 人的糖尿病腎病和正常腎臟組織的腎小管中RACK1(GNB2L1)的表達(dá)Figure 1 Expression of RAC1 in diabetic nephropathy group and healthy control group

圖2 通過KEGG搜索RACK1參與的信號(hào)通路Figure 2 Pathway of RACK1 by KEGG

2.3 HK-2細(xì)胞中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平的表達(dá)

real-time PCR示高糖組RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平均較對(duì)照組和甘露醇組均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖3)。

2.4 糖尿病腎病動(dòng)物模型中蛋白尿變化

與對(duì)照組相比,糖尿病腎病組小鼠體質(zhì)量無明顯變化。糖尿病腎病組血糖水平從STZ注射2周后開始升高,一直維持在較高水平,糖尿病腎病組腎質(zhì)量/體質(zhì)量(KW/BW)、尿白蛋白肌酐比(ACR)和24 h尿蛋白定量(UAE)均明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與對(duì)照組和甘露醇組相比，***P<0.001圖3 高糖刺激的HK-2細(xì)胞中RACK1、STAT1和STAT3的表達(dá)Figure 3 Expression of RACK1，STAT1and STAT3 in HK-2 cells with high glucose

與對(duì)照組比較，***P<0.001，****P<0.000 1圖4 糖尿病腎病小鼠體質(zhì)量、血糖及蛋白尿變化Figure 4 Changes of body weight，kidney weight/ body weight，blood glucose，ACR and UAE in diabetic nephropathy animal model

2.5 糖尿病腎病動(dòng)物模型中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平的表達(dá)

real-time PCR示糖尿病腎病組中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平較正常組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 糖尿病腎病動(dòng)物模型的組織學(xué)變化

PAS染色示糖尿病腎病組中腎小球體積增大,系膜增生,腎小管擴(kuò)張;免疫熒光示p-STAT1染色陽(yáng)性,主要位于腎小管上皮細(xì)胞(見圖6);p-STAT3染色陰性。

與對(duì)照組相比，**P<0.01，****P<0.000 1圖5 糖尿病動(dòng)物模型中RACK1、STAT1和STAT3的表達(dá)Figure 5 Expression of RACK1,STAT1 and STAT3 in diabetic nephropathy animal model

圖6 糖尿病腎病動(dòng)物模型腎小管的組織學(xué)變化Figure 6 PAS and immunofluoresence staining of tubule tissues in diabetic nephropathy animal model

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,約50%患者存在糖尿病腎病,是導(dǎo)致終末期腎衰竭的首要原因,但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。糖尿病腎病存在明顯的腎小球病變,文獻(xiàn)報(bào)道[3]的關(guān)于發(fā)病機(jī)制的研究多集中于腎小球。Bonventre[1]報(bào)道,腎小管病變也是不可或缺的,甚至早于腎小球病變,而且腎小管的病變?yōu)橹鲃?dòng)過程,并不是繼發(fā)于腎小球病變,且腎功能的異常與腎小管損害密切相關(guān),Tang等[2]甚至提出了糖尿病腎小管病(diabetic tubulopathy)的概念。近年來許多新的證據(jù)提示腎小管,尤其是近端小管,是糖尿病腎病的啟動(dòng)者,參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[4]。

RACK1是WD40重復(fù)蛋白家族中一員,被報(bào)道參與數(shù)種疾病的進(jìn)展[5-7]。有研究表明RACK1過表達(dá)抑制成年鼠心肌缺血再灌注的心肌細(xì)胞凋亡[8];RACK1下調(diào)可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增生、侵襲及轉(zhuǎn)移[9];RACK1能促進(jìn)TGF-β1調(diào)節(jié)前纖維通路的激活和肝星狀細(xì)胞(HSCs)的轉(zhuǎn)分化、增生和遷移,RACK1敲除后抑制硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化[10];本課題組前期試驗(yàn)第一次證明RACK1在腎纖維化中的作用,說明其可能參與終末期腎臟病的發(fā)生發(fā)展[11]。但其在糖尿病腎小管病中的作用及機(jī)制卻未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù),初步探討及分析其在糖尿病腎小管病中表達(dá),發(fā)現(xiàn)RACK1在人的糖尿病腎病的腎小管中表達(dá)升高。

Tang等[12]報(bào)道糖化白蛋白可引起近端腎小管細(xì)胞中STAT-1升高,可被羅格列酮抑制,降低糖尿病腎病中的促炎癥因子,如ICAM-1、IL-6。Berthier等[13]報(bào)道在人糖尿病腎病的腎活檢標(biāo)本中,STAT-1和STAT-3在腎小管間質(zhì)中明顯升高。通過KEGG搜索,發(fā)現(xiàn)RACK1參與Jak-STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用。故推測(cè)RACK1可能是通過Jak-STAT信號(hào)通路參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

首先本研究證實(shí)在高糖刺激HK-2細(xì)胞中,RACK1、STAT1和STAT3均明顯升高。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[2]推測(cè)糖尿病腎小管病可能是糖尿病腎病的啟動(dòng)者,推動(dòng)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在早期糖尿病腎小管病中的表達(dá)及可能的機(jī)制,利用鏈脲佐菌素建立糖尿病腎病的模型,我們發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素注射后8周小鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)逐漸開始升高,12周ACR小于0.1 μg/mg,糖尿病腎病組腎質(zhì)量/體質(zhì)量升高,光鏡下腎小球輕度增大,無系膜增寬等改變,提示處于早期腎小球高濾過狀態(tài),早期糖尿病腎病模型建立成功。real-time PCR提示糖尿病腎病組中RACK1、STAT1和STAT3均明顯升高,由此可見,早期糖尿病腎病中,RACK1明顯升高,組織學(xué)免疫熒光染色示腎小管中p-STAT1陽(yáng)性,但p-STAT3陰性,推測(cè)RACK1可能主要是通過磷酸化STAT1而激活下游靶基因來發(fā)揮作用的。但要闡明RACK1與p-STAT1的關(guān)系,以及在糖尿病腎小管病中的機(jī)制,仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病腎小管病可能為糖尿病腎病的啟動(dòng)者,與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)RACK1在糖尿病腎小管病中的作用,可能通過磷酸化STAT1進(jìn)而激活Jak-STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游靶基因來發(fā)揮作用,若可通過干預(yù)RACK1及其信號(hào)通路,早期阻斷糖尿病腎病的啟動(dòng)因素——糖尿病腎小管病,將為避免糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展做出巨大貢獻(xiàn),為上億糖尿病患者帶來福音。