右美托咪定預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷及自噬的影響

胡朝勇,郭永清

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院山西省人民醫(yī)院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:gyq106968@aliyun. com)

急性腦梗死是臨床常見的腦血管疾病,致殘率及致死率均較高,雖然近年來溶栓治療手段不斷進(jìn)步,但缺血腦組織在溶栓過程中發(fā)生血流再灌注可加重組織損傷,即缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷[1,2]。腦I/R損傷的可能機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡等,其中自噬是受到越來越多關(guān)注的機(jī)制之一[3,4]。已有研究表明,腦I/R過程中細(xì)胞自噬加劇,這可能是腦組織在缺血缺氧及I/R條件下自我保護(hù)的代償機(jī)制之一[5];多種具有神經(jīng)保護(hù)功能的藥物能夠在腦I/R損傷過程中激活自噬,這可能是不同藥物發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能的分子機(jī)制[6-8]。因此,調(diào)節(jié)自噬也被認(rèn)為是減輕腦I/R損傷的重要靶點(diǎn)。

右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是臨床廣泛使用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物,多用于全麻輔助和ICU鎮(zhèn)靜,通過高選擇性激活α2腎上腺素能受體發(fā)揮作用。Dex預(yù)處理能夠減輕腦I/R損傷及I/R局部的炎癥反應(yīng),但Dex在腦I/R損傷過程中對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用尚不明確。因此,本實驗將以腦I/R損傷大鼠為對象,探討Dex對大鼠腦I/R損傷及自噬的影響,旨在進(jìn)一步明確Dex在腦I/R損傷過程中的保護(hù)作用及相應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心,8-10周齡、150-180 g,生產(chǎn)許可證:許可證號 SCXK(晉)2019-0004;飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h的光/暗周期、濕度55%-65%、溫度20-24 ℃,自由攝食飲水。

1.2 主要試劑及儀器

右美托咪定(江蘇恒瑞公司)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司,Beclin-1, LC3、p-AMPK的抗體購自英國Abcam公司。正置顯微鏡購自日本尼康公司,透射電鏡購自日本日立公司,凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔公司。

1.3 動物分組、造模及給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對照組、I/R組和Dex組,每組12只。對照組進(jìn)行假手術(shù)操作,分離一側(cè)頸動脈,不做其他干預(yù);I/R組在造模前30 min腹腔注射0.25 ml生理鹽水;Dex組在造模前30 min,腹腔注射0.5 ml/kg右美托咪定生理鹽水稀釋至0.25 ml。I/R組和Dex組采用線栓法建立腦I/R模型,腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉,做頸正中切口后分離一側(cè)頸總動脈,切開并向頭端置入一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的肝素浸泡過的尼龍絲線栓,感到有阻力后停止,保留線栓90 min,而后取出,完成造模、縫合切口。

1.4 神經(jīng)功能評分

再灌注24 h時,按照Longa等[9]研究中的神經(jīng)功能評分進(jìn)行評價,具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Standard of neurological function score

評分 標(biāo)準(zhǔn)0分無神經(jīng)功能缺損癥狀1分缺血對側(cè)前爪屈曲2分行走時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)3分行走時向?qū)?cè)傾倒4分意識喪失

1.5 腦梗死面積的TTC染色檢測

再灌注24 h時,每組隨機(jī)選擇6只大鼠,麻醉狀態(tài)下斷頭處死后取腦組織,-20 ℃冰凍20 min,而后沿冠狀面切成每片厚度2 mm的腦片,共5片,在2%TTC溶液中避光孵育30 min,而后在10%多聚甲醛溶液中固定,數(shù)碼相機(jī)拍照記錄,用ImageJ軟件計算5張切片中的梗死面積,按照公式(A1+A2+A3+A4+A5)/(S1+S2+S3+S4+S5)×100%計算腦梗死面積,A1-A5為每一片的腦梗死面積，S1-S5為每一片的腦組織總面積。

1.6 自噬小體檢測

再灌注24 h時,每組隨機(jī)選擇6只大鼠,斷頭法處死后取缺血腦組織、約1 mm3,在2.5%戊二醛溶液中固定并保存,檢測時用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗組織塊3次,放入1%鋨酸中、4 ℃固定1 h,70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水后環(huán)氧樹脂包埋,-80 ℃聚合24 h,制作60-70 nm厚度的切片并用3%檸檬酸鉛染色,最后在透射電鏡下觀察,隨機(jī)選擇10個細(xì)胞并對細(xì)胞內(nèi)的自噬小體進(jìn)行計數(shù)。

1.7 Western blot檢測Beclin-1、LC3、p-AMPK表達(dá)

取1.6中6只大鼠剩余的缺血腦組織,加入RIPA裂解液并勻漿,勻漿液12 000 r/min,離心10 min,分離上清后測定蛋白含量,取30 μg蛋白樣本進(jìn)行Western blot檢測,在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,而后電轉(zhuǎn)移至NC膜,NC膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,放入1 ∶1 000稀釋的Beclin-1、LC3、p-AMPK、AMPK抗體中4 ℃孵育過夜;加1 ∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗,室溫孵育1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶,根據(jù)蛋白條帶的灰度值計算蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件錄入數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex對I/R大鼠神經(jīng)功能評分的影響

與對照組比較,I/R組的神經(jīng)功能評分明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05,見圖1)。

2.2 Dex對I/R大鼠腦梗死面積的影響

與對照組比較,I/R組的腦梗死面積明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠的腦梗死面積明顯縮小(P<0.05,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖1 三組大鼠神經(jīng)功能評分的比較Figure 1 Comparison of neurological function among three groups

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖2 三組大鼠腦梗死體面積的比較Figure 2 Comparison of cerebral infarction volume among three groups

2.3 Dex對I/R大鼠缺血腦組織中自噬小體形成的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中自噬小體形成增多;與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中自噬小體形成進(jìn)一步增多(見圖3)。

黃色箭頭所指為自噬小體;與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖3 三組大鼠缺血腦組織中的自噬小體Figure 3 Autophagy bodies in ischemic brain tissues after different treatment

2.4 Dex對I/R大鼠缺血腦組織中自噬標(biāo)志基因表達(dá)的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,見圖4)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖4 三組大鼠缺血腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量的比較Figure 4 Comparison of Beclin-1, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression in ischemic brain tissues among three groups

2.5 Dex對大鼠缺血腦組織中自噬信號通路激活的影響

與對照組比較,I/R組大鼠缺血腦組織中p-AMPK的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05);與I/R組比較,Dex組大鼠缺血腦組織中p-AMPK的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05，見圖5)。

與對照組比較,*P<0.05;與I/R比較,#P<0.05圖5 三組大鼠缺血腦組織中p-AMPK表達(dá)量的比較Figure 5 Comparison of p-AMPK expression in ischemic brain tissues among three groups

3 討論

器官組織缺血后恢復(fù)血液灌注,缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象,稱為缺血-再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷時對腦組織造成損傷的主要因素,不是缺血本身,而是恢復(fù)血液供應(yīng)后過量的自由基生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細(xì)胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等[3,4]。臨床上頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、心臟體外循環(huán)、器官移植、心肺復(fù)蘇、神經(jīng)外科介入手術(shù)、感染等都可能發(fā)生腦缺血后再灌注損傷。由于大腦對缺氧和缺血極其敏感,圍手術(shù)期腦缺血再灌注損傷可能成為術(shù)后恢復(fù)延遲、術(shù)后譫妄和術(shù)后認(rèn)知功能障礙和死亡的重要危險因素之一,因此圍術(shù)期腦保護(hù)是保障患者術(shù)后良好康復(fù)的重要措施。

研究顯示,右美托咪定(Dex)通過激活 PI3K/Akt 途徑,抑制細(xì)胞凋亡,阻止casepase-3 級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。陳萌等[6]、Zhang等[7]、Ahsan等[8]在腦I/R損傷中使用具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物干預(yù)并觀察到細(xì)胞自噬被激活,提示激活自噬是神經(jīng)保護(hù)藥物減輕腦I/R損傷的機(jī)制。Dex減少缺血缺氧性損傷,發(fā)揮腦保護(hù)作用,Chi等[10]通過動物實驗證實,出血時使用右美托咪定可減少局部的腦血流量(CBF)和腦代謝率(CMR),保持腦氧供需平衡狀態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。顱腦外傷患者圍手術(shù)期給予右美托咪定鎮(zhèn)靜有利于腦組織的氧供需平衡或促進(jìn)受損組織的血液灌注[11]。研究顯示，Dex對腦缺血再灌注損傷大鼠認(rèn)知功能及神經(jīng)功能具有保護(hù)作用[12]。全麻手術(shù)老年患者應(yīng)用右美托咪定可減輕術(shù)后認(rèn)知功能障礙,機(jī)制可能與降低線粒體膜電位,減少線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性損傷有關(guān)[13]。右美托咪定抑制N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過度激活,減少興奮性氨基酸的釋放,降低興奮性氨基酸毒性[14],Dex可抑制 NF-κB 的激活,降低 TNF-α、IL-6 水平,減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)損傷[15];Dex預(yù)處理可抑制線粒體凋亡通路,抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載,減輕神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷[16],調(diào)節(jié)凋亡和自噬。本實驗結(jié)果顯示,I/R大鼠的神經(jīng)功能評分明顯增加,腦組織TTC染色后顯示明顯的腦梗死病灶,Dex預(yù)處理后大鼠的神經(jīng)功能評分降低、腦梗死體積均較I/R大鼠明顯減少,提示Dex對大鼠腦I/R損傷具有保護(hù)作用。

自噬是近年來發(fā)現(xiàn)在腦I/R損傷過程中起保護(hù)作用的生物學(xué)環(huán)節(jié),細(xì)胞內(nèi)各種基質(zhì)及細(xì)胞器通過溶酶體系統(tǒng)降解,是保證細(xì)胞在各種壓力環(huán)境下存活的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)。腦I/R損傷過程中,自噬的激活是機(jī)體自我保護(hù)的代償機(jī)制,能夠平衡細(xì)胞合成和分解代謝,為缺血缺氧的細(xì)胞供能并在一定程度上減輕I/R損傷。在缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下自噬作為機(jī)體的一種防御機(jī)制,通過適時清除損傷及老化的細(xì)胞器,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及細(xì)胞的正常生長。缺血再灌注損傷時,線粒體產(chǎn)生的活性氧爆發(fā)以及線粒體通透性的改變均可誘發(fā)自噬,而自噬對于維持細(xì)胞線粒體的功能也扮演著重要的角色。有研究在脊髓、肺、腸缺血再灌注動物模型中觀察到Dex能激活自噬減輕組織缺血再灌注損傷[17-19]。

AMPK通路是目前已知調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵信號通路,信號分子AMPK能夠感受細(xì)胞外能量變化并調(diào)控能量代謝;AMPK磷酸化激活不僅對缺血缺氧、I/R等損傷具有保護(hù)作用,也能在缺血缺氧、I/R過程中激活自噬[20-22]。本實驗結(jié)果顯示,右美托咪定預(yù)處理后大鼠缺血腦組織中自噬小體形成增加、自噬標(biāo)志基因Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)上調(diào)、自噬信號通路p-AMPK激活,提示Dex預(yù)處理能激活大鼠腦I/R損傷過程中的自噬和AMPK通路。自噬的激活可能是腦組織自我保護(hù)的代償機(jī)制,也可能是Dex減輕腦I/R損傷、腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述,Dex預(yù)處理能減輕大鼠腦I/R損傷并促進(jìn)自噬,激活A(yù)MPK通路是可能的分子機(jī)制,但AMPK在Dex減輕腦I/R損傷并促進(jìn)自噬中的直接作用仍有待進(jìn)一步研究證實。