超聲微泡聯(lián)合EPO對大鼠心肌梗死后非梗死區(qū)心肌OPN表達的影響及其與心室重構的相關性

任云霞,潘龍飛,李麗君,高彥霞*

(1西安市胸科醫(yī)院漿膜腔科,西安 710000;2西安交通大學第二附屬醫(yī)院急診科;3西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內科;*通訊作者,E-mail:972264140@qq.com;#共同通訊作者,E-mail:lilijun3162003@aliyun.com)

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的疾病,每年估計有超過3百萬人發(fā)生ST段抬高的心肌梗死,有超過4百萬人發(fā)生非ST段抬高的心肌梗死[1]。盡管再灌注治療使心肌梗死患者的死亡率下降,但急性心肌梗死后心衰的患者是增加的[2],心肌梗死后的心室重構、心力衰竭嚴重影響了患者的生存質量。目前證實促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)除了能促進紅細胞生成外,在心肌細胞的凋亡、炎癥反應及心室重構方面有抑制作用,進而改善心臟功能[3,4]。超聲輻照聯(lián)合靜脈輸注微泡有輔助溶栓、促進血管新生和改善心肌微循環(huán)等作用[5,6]。但對于超聲微泡聯(lián)合EPO是否可以改善心室重構、縮小梗死面積及其機制,目前研究較少。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)作為一種重要的細胞外基質蛋白,因參與骨基質礦化和重吸收過程,介導骨組織細胞與骨基質連接而得名。研究發(fā)現(xiàn),隨著心室重構的進展,OPN的表達明顯上調,與心室重構存在顯著的相關性[7]。本研究通過超聲介導微泡聯(lián)合EPO干預心肌梗死大鼠,觀察心肌梗死后OPN表達的變化和心室重構情況,并進一步探討影響心室重構的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

微泡采用SonoVue(意大利Bracco公司產,無菌凍干粉狀,打開包裝后注入10 ml生理鹽水搖勻,微泡的濃度為(2-5)×107個/ml,微泡平均直徑為2.5 μm左右);超聲診斷儀(Sonosite180 Plus,美國,C60/5-2 MHz 60 mm凸陣探頭,頻率3.5 MHz,機械指數1.3),由西安交通大學第二附屬醫(yī)院超聲科提供。重組人促紅細胞生成素(3 000 IU/支,山東阿華生物藥業(yè)有限公司),鼠單抗OPN抗原抗體(北京中杉金橋生物有限公司),兔抗鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)Image Pro Plus 4.5圖像分析系統(tǒng)(美國MediaCybernetics公司)。

1.2 動物分組及心肌梗死模型制備

105只雄性10周齡SD大鼠,動物生產許可證號:SCXK(陜)2012-003,清潔級,體質量(300±30)g,由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供。參照文獻制作急性心肌梗死模型[6]。將造模成功的90只大鼠隨機分為超聲+微泡+EPO組、EPO組及單純心肌梗死組。超聲+微泡+EPO組和EPO組心肌梗死模型制備后立即經腹腔注射給予EPO(3 000 IU/kg),而單純心肌梗死組則經腹腔給予等量生理鹽水。分別在心肌梗死后24 h和48 h,用10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉后,固定于手術臺,用1 ml注射器抽取配好的微泡造影劑1 ml,經舌下靜脈緩慢給予超聲+微泡+EPO組1 ml的超聲微泡造影劑(濃度為2×107-5×107/ml),靜推時間為10 min,同時按超聲作用5 s,停5 s方式,用診斷超聲儀探頭照射心肌梗死區(qū),共10 min。而EPO組和單純心肌梗死組則經舌下靜脈緩慢給予1 ml生理鹽水,靜推時間為10 min,超聲照射方式同前。

1.3 心臟標本的采集與固定

于心肌梗死后28 d處死大鼠,取出心臟,去除左右心房及血管組織,并用生理鹽水沖洗干凈,于心尖與結扎線連線中點處用刀片沿著與左心室長軸垂直的切面將心臟成3-4 mm厚的組織片,用4%多聚甲醛固定24-48 h,石蠟包埋。切成5 μm厚度的切片,用多聚賴氨酸處理。對心肌梗死后28 d大鼠心肌組織切片行Masson染色,光學顯微鏡下獲取10倍圖像,并用Image-Pro Plus 4.5軟件分別測量梗死區(qū)面積、整個左心室面積和左心室腔面積,按梗死面積百分比=梗死區(qū)面積/(整個左心室面積-左心室腔面積)×100%的公式計算梗死面積百分比。免疫組化檢測Ⅰ型膠原、骨橋蛋白的含量,用Image Pro Plus 4.5分別計算OPN和Ⅰ型膠原的總IOD值,計算平均值,并進行相關性分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Masson染色結果

10倍光學顯微鏡下獲取的圖像見圖1。超聲+微泡+EPO組梗死面積百分比最小(P<0.05),單純心肌梗死組最大(P<0.05,見表1)。

A.超聲+微泡+EPO組 B.EPO組 C.單純心肌梗死組圖中紅色為心肌組織,藍色為膠原圖1 梗死后28 d心肌Masson染色 (×10)Figure 1 Masson staining of myocardium at 28 d after myocardial infarction (×10)

組別梗死面積(%)超聲+微泡+EPO組15.82±1.18?#EPO組21.69±0.78#單純心肌梗死組28.66±2.26

與EPO組比較,*P<0.05;與單純心肌梗死組比較,#P<0.05

2.2 免疫組化結果

2.2.1 骨橋蛋白 心肌梗死后28 d大鼠心肌組織行骨橋蛋白免疫組化檢測,骨橋蛋白陽性表達為位于細胞胞質內的棕黃色顆粒(見圖2)。用Image-Pro Plus 4.5軟件計算骨橋蛋白的平均IOD值,超聲+微泡+EPO組與EPO組與單純心肌梗死組相比,OPN含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見表2)。

A.超聲+微泡+EPO組 B.EPO組 C.單純心肌梗死組圖2 梗死后28 d免疫組化圖像分析OPN含量 (×400)Figure 2 Analysis of OPN content by immunohistochemical image at 28 d after myocardial infarction (×400)

組別IOD值超聲+微泡+EPO組230320.6±16512.9??##EPO組293543.4±28224.2##單純心肌梗死組356809.9±15318.9

與EPO組比較,**P<0.01;與單純心肌梗死組比較,##P<0.01

2.2.2 Ⅰ型膠原 心肌梗死后28 d大鼠非梗死區(qū)心肌組織行Ⅰ型膠原免疫組化檢測,Ⅰ型膠原陽性表達位于細胞間質、呈棕黃色(見圖3),用Image-Pro Plus 4.5軟件計算Ⅰ型膠原的平均IOD值,超聲+微泡+EPO組和EPO組較單純心肌梗死組Ⅰ型膠原含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見表3)。而超聲+微泡+EPO組Ⅰ型膠原含量最少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A.超聲+微泡+EPO組 B.EPO組 C.單純心肌梗死組DAB顯色(黃色),松木蘇復染(藍色),圖中箭頭所示即為Ⅰ型膠原陽性表達,位于細胞間質,呈棕黃色圖3 梗死后28 d非梗死區(qū)大鼠心肌組織Ⅰ型膠原含量 (免疫組化染色,×400)Figure 3 Immunohistochemical staining of type Ⅰ collagen in myocardium of non-infarcted area at 28 d after infarction (×400)

組別IOD值超聲+微泡+EPO組172136.8±17323.6??##EPO組284949.9±18539.9##單純心肌梗死組364585.9±22947.3

與EPO組比較,**P<0.01;與單純心肌梗死組比較,##P<0.01

2.2.3 骨橋蛋白與Ⅰ型膠原的相關性分析 用線性相關進行分析發(fā)現(xiàn),Ⅰ型膠原的IOD值與骨橋蛋白的IOD值之間存在相關性,且呈正相關(r=0.897,P<0.01,見圖4)。

圖4 非梗死區(qū)Ⅰ型膠原的平均IOD值與OPN平均IOD值之間相關性的散點圖Figure 4 Scatter plot of the correlation between the average IOD value of type Ⅰ collagen and the average IOD value of OPN in non-infarct area

3 討論

心室重構是急性心肌梗死發(fā)展成為心衰的重要病理生理基礎,參與了整個病程的始終,是影響急性心肌梗死預后的主要原因[8]。如何減少心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率和死亡率,改善心肌梗死患者的預后已成為心血管領域研究重點之一[9]。研究顯示,EPO除促進紅細胞生成外,還具有如抗凋亡、促進血管新生、調節(jié)炎癥反應等作用,對腦組織[10]、腎臟[11]、肝臟[12]和心臟[13]等多個器官都有保護作用。Lu等[14]通過離體心臟模型研究發(fā)現(xiàn),EPO能減輕心肌缺血再灌注損傷,并可減少心肌梗死面積。EPO可以刺激血管新生,進而增加心肌供血[15],減少心肌梗死面積、抑制心室重構進而提高心功能。心肌梗死面積的大小與血流動力學紊亂和神經內分泌激活密切相關,可作為預測心室重構和心衰進展的重要指標[16]。王琬婷等[17]通過體內動物模型研究發(fā)現(xiàn),EPO對壓力負荷過重所引起的的小鼠左心室重構具有抑制作用,并可降低死亡率。有實驗證實[18],促紅細胞生成素聯(lián)合左卡尼汀可有效改善腎性貧血,降低血漿內皮素水平,抑制左心室重構且安全性較高,臨床價值較高。本實驗發(fā)現(xiàn),超聲+微泡+EPO組梗死面積百分比最小(P<0.05),單純心肌梗死組梗死面積百分比最大(P<0.05),說明超聲微泡聯(lián)合EPO及EPO二者均可減少心肌梗死面積,但超聲微泡聯(lián)合EPO聯(lián)合使用效果明顯強于單用EPO,推測其可能通過刺激新生血管的形成,增加心肌血液供應,從而減少心肌梗死面積。

OPN是一種多功能蛋白,在多種生物學過程中起著重要作用,包括骨吸收、免疫細胞激活、抑制血管鈣化和細胞外基質重構[19]。心肌梗死后梗死區(qū)和非梗死區(qū)OPN含量都明顯增加[20]。在AMI后的心室重構中,在AngⅡ、缺氧、細胞因子等作用下,OPN及整合素合成過量增加,調節(jié)成纖維細胞增殖、遷移和分泌過量的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等大分子物質,進一步加重心室重構。

在急性心肌梗死后心室重構中,膠原沉積為決定性影響因素[21],是心室重構的重要環(huán)節(jié),所以減少膠原沉積對預防和逆轉心室重構起著非常重要的作用。Ⅰ型膠原的大量沉積會導致心室順應性減低、僵硬度增加、心肌細胞供血障礙及心功能減退等,所以預防和逆轉膠原沉積很有必要。Nishiya等[22]發(fā)現(xiàn),在心肌梗死后給予EPO,能減輕非梗死區(qū)心肌纖維化和抑制相關基因的表達。本實驗發(fā)現(xiàn),與單純心肌梗死組相比,EPO組及超聲+微泡+EPO組的OPN含量及Ⅰ型膠原含量明顯較低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明EPO及超聲+微泡+EPO均可抑制組織中OPN及Ⅰ型膠原的表達;而超聲+微泡+EPO組OPN及Ⅰ型膠原含量最少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明超聲+微泡+EPO三者聯(lián)合較單用EPO抑制OPN及Ⅰ型膠原表達效果更加顯著,驗證了EPO具有抑制OPN表達及減少Ⅰ型膠原含量,從而抑制心室重構的作用,而超聲介導微泡可增強EPO的抑制心室重構的作用,其機制可能為超聲介導微泡爆破時產生的沖擊波和微射流,可使周圍組織中細胞膜產生可逆或不可逆的穿孔,使細胞膜及血管壁的通透性增加;同時沖擊波及微射流可以直接促進藥物及基因等物質進入周圍組織或細胞內,增強細胞對藥物的攝入能力,從而提高藥物在靶組織的濃度,提高藥物療效,減少藥物的使用量。另OPN的表達與Ⅰ型膠原含量呈正相關,推測EPO通過下調OPN表達進而抑制Ⅰ型膠原的表達來減輕心室重構。

綜上所述,超聲介導微泡聯(lián)合EPO干預心肌梗死大鼠,發(fā)現(xiàn)EPO可減少心肌梗死面積和減少Ⅰ型膠原含量,進而減輕心室重構,且發(fā)現(xiàn)OPN的表達下調可能為EPO治療心肌梗死后心室重構的機制之一。超聲介導微泡可增加EPO的上述治療作用。但EPO下調OPN的具體機制是什么?是通過何種信號途徑?還需進一步探討。