miRNA-30e-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的機制研究

徐 澤,黃 威,馬銳祥,史國光,尚希福,朱 晨

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,安徽省立醫(yī)院骨科,合肥 230001;*通訊作者,E-mail:zhuchen19790820@sina.com)

骨肉瘤是常見的原發(fā)性惡性腫瘤,好發(fā)于長骨干骺端,0-19歲兒童和青少年發(fā)病率較高。臨床常見表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動受限以及肌肉萎縮等癥狀[1]。骨肉瘤的主要治療方法是手術(shù)切除、輔助化療和放射治療。在過去20年中治療效果已取得了很大的進步,非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的5年生存率已提升至65%左右[2,3]。然而不幸的是,大多數(shù)患者確診時已是晚期,預(yù)后差且病死率較高。故而,尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點對骨肉瘤的治療具有重大意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的小分子RNA,在腫瘤、代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胚胎干細(xì)胞等方面具有多種功能[4-6]。雖然miRNA不能編碼蛋白質(zhì),但其可通過與下游靶基因3’-UTR區(qū)的堿基互補配對來降解mRNA或直接阻斷蛋白質(zhì)翻譯[7,8]。miRNA-30e-5p作為miRNA-30家族中的一員,已經(jīng)證實在前列腺癌、頭頸部腫瘤和膀胱癌組織中表達下調(diào),發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[9-11]。但miRNA-30e-5p在骨肉瘤中的作用仍不明確。因此,本研究將分析miRNA-30e-5p對骨肉瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響并探究其分子機制,以期為骨肉瘤的臨床治療提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本

選擇2018-09～2019-09由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科手術(shù)室收集的30對骨肉瘤組織和癌旁正常組織,所有的組織快速冷凍于液氮,其后于-80 ℃長期保存用于后續(xù)實驗。所有入選患者均無放療和化療史。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS、Saos-2、MG-63和人成骨細(xì)胞hFOB購于ATCC細(xì)胞庫(美國)。CCK-8試劑盒、Trizol試劑由合肥颯英斯生物試劑公司提供。Transwell小室由Corning公司(美國)提供。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒由Abcam生物公司(英國)提供。RPMI-1640和胰酶溶液由Hyclone公司(美國)提供;opti-MEM和胎牛血清由Gibco生物公司(美國)提供。miRNA-30e-5p mimics(模擬物)、miRNA-30e-5p inhibitor(抑制物)、mimics NC(模擬物陰性對照)、inhibitor NC(抑制物陰性對照)和實驗中所有引物均由安徽(滁州)通用生物公司提供。USP22、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH抗體由CST生物公司(美國)提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮中凍存的的骨肉瘤和成骨細(xì)胞取出，迅速在37 ℃恒溫水浴鍋搖晃，使其快速融化，隨后轉(zhuǎn)移至15 ml無菌離心管中并加入5 ml培養(yǎng)基重懸、離心。用含有10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)單層細(xì)胞生長至70%-90%，胰酶消化細(xì)胞，傳代繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

用PBS洗滌對數(shù)生長期的細(xì)胞,胰酶消化后重懸、計數(shù)。將6×105個細(xì)胞接種于6孔板,繼續(xù)培養(yǎng)24 h進行轉(zhuǎn)染。分別構(gòu)建miRNA-30e-5p過表達細(xì)胞模型,分為mimics NC組(模擬物陰性對照)和miRNA-30e-5p mimics組;構(gòu)建miRNA-30e-5p敲低細(xì)胞模型,分為inhibitor NC組(抑制劑陰性對照)和miRNA-30e-5p inhibitor組。分別用250 μl opti-MEM稀釋mimics NC、miRNA-30e-5p mimics、inhibitor NC和miRNA-30e-5p inhibitor,同時使用250 μl opti-MEM稀釋Lipofectamine 2000,將兩組輕柔混勻,室溫靜止20 min。加500 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物至6孔板,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用于miRNA-30e-5p轉(zhuǎn)染效率的檢測。

1.5 qRT-PCR檢測miRNA表達情況

Trizol法抽提組織和細(xì)胞中RNA,使用天根生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒對miRNA進行加尾和反轉(zhuǎn)錄。用熒光定量試劑盒檢測樣品中miRNA-30e-5p表達量,以U6作為內(nèi)參。miRNA-30e-5p上游引物:5′-GGCGTGTAAACATCCTTGACTG-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的U2OS細(xì)胞消化計數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液,取100 μl接種至96孔板。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h,每天同一時間每孔中加入10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm時吸光度OD值。

1.7 克隆形成實驗

將轉(zhuǎn)染后的U2OS細(xì)胞消化計數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml的細(xì)胞懸液,取100 μl接種至6孔板,并補齊培養(yǎng)基至2 ml。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d至肉眼可見克隆形成,終止培養(yǎng),PBS洗滌后中性甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色1 h,流水洗凈烘干,顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

轉(zhuǎn)染后生長狀態(tài)良好的骨肉瘤U2OS細(xì)胞消化計數(shù),用無血清培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度,接種4×104個細(xì)胞于Transwell上室,下室加入10%血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,0.1%結(jié)晶紫染色后用棉簽輕柔擦去上室內(nèi)的基質(zhì)膠和細(xì)胞,顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù),取平均值進行分析。

1.9 Targetscan網(wǎng)站進行靶基因預(yù)測

采用Targetscan網(wǎng)站在線進行miRNA-30e-5p靶基因預(yù)測。

1.10 Western blot檢測蛋白表達

將轉(zhuǎn)染后的U2OS細(xì)胞冰上裂解，提取總蛋白，進行變性處理。蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；USP22、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH(稀釋比均為1 ∶1 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)一抗4 ℃冰箱過夜，PBST洗膜3次，每次5 min；兔二抗(稀釋比均為1 ∶5 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；采用ECL發(fā)光試劑進行曝光。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中低表達

首先檢測骨肉瘤臨床標(biāo)本中miRNA-30e-5p的表達水平,qRT-PCR結(jié)果表明與癌旁正常組織相比,腫瘤組織中miRNA-30e-5p水平顯著降低(P<0.05,見圖1)。隨后,分析了人成骨hFOB細(xì)胞和骨肉瘤U2OS、Saos-2、MG-63細(xì)胞中miRNA-30e-5p的表達情況,qRT-PCR結(jié)果表明其在骨肉瘤細(xì)胞中也顯著低表達(P<0.05,見圖1)。

圖1 miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達情況Figure 1 Expression of miRNA-30e-5p in osteosarcoma tissues and cells

2.2 過表達miRNA-30e-5p抑制U2OS細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移

U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30e-5p mimics后,與對照組相比,過表達組miRNA-30e-5p顯著升高(P<0.05,見圖2A)?？寺⌒纬珊虲CK-8實驗表明,過表達組細(xì)胞存活率和克隆數(shù)量顯著降低(P<0.05,見圖2B、C)。Transwell實驗表明,相比于對照組,過表達組細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯減少(P<0.05,見圖2D)。

2.3 下調(diào)miRNA-30e-5p表達促進U2OS細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移

U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30e-5p inhibitor后,相比與對照組,抑制組miRNA-30e-5p顯著降低(P<0.05,見圖3A)。克隆形成和CCK-8實驗表明,抑制組細(xì)胞存活率和克隆數(shù)量顯著升高(P<0.05,見圖3B、C)。Transwell實驗表明,抑制組細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯增加(P<0.05,見圖3D)。

2.4 miRNA-30e-5p能抑制USP22表達

使用在線預(yù)測網(wǎng)站對miRNA-30e-5p的靶基因進行分析,結(jié)果顯示miRNA-30e-5p可能與USP22存在靶向關(guān)系(見圖4)。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn),過表達miRNA-30e-5p能抑制USP22的表達(見圖4);抑制miRNA-30e-5p能增加USP22的蛋白水平(見圖4)。證實miRNA-30e-5p能夠靶向抑制USP22的表達。

圖2 過表達miRNA-30e-5p對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響Figure 2 Effect of miRNA-30e-5p overexpression on the proliferation and metastasis of osteosarcoma U2OS cells

圖3 抑制miRNA-30e-5p表達對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響Figure 3 Effect of inhibition of miRNA-30e-5p expression on the proliferation and metastasis of osteosarcoma U20S cells

圖4 miRNA-30e-5p對USP22的調(diào)控作用Figure 4 Regulation of miRNA-30e-5p on USP22

2.5 miRNA-30e-5p能抑制U2OS細(xì)胞EMT過程

Western blot實驗證實,過表達miRNA-30e-5p后E-cadherin蛋白水平上調(diào)、N-cadherin蛋白水平下調(diào)(見圖5)。相反,抑制miRNA-30e-5p表達后E-cadherin蛋白水平下調(diào)、N-cadherin蛋白水平上調(diào)(見圖5)。證實miRNA-30e-5p能夠抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞的EMT過程。

圖5 miRNA-30e-5p對EMT相關(guān)蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miRNA-30e-5p on E-cadherin and N-cadherin protein expression

3 討論

miRNA在腫瘤發(fā)展過程中對調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和生物學(xué)過程具有顯著作用。研究發(fā)現(xiàn),miRNA-21、miRNA-320a、miRNA-210-5p等異常表達會影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后[12-14],說明miRNA與骨肉瘤的惡性進展密切相關(guān)。已有研究表明miRNA-30e-5p在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[11]、前列腺癌[15]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]等多種腫瘤中低表達,并能抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但目前尚無有關(guān)miRNA-30e-5p在骨肉瘤中的潛在功能和機制的研究。本研究首次證實,miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中低表達,初步表明其在骨肉瘤的惡性發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌功能。細(xì)胞生物學(xué)實驗表明miRNA-30e-5p能夠抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

miRNA是一種長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,在機體生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。miRNA通過堿基互補的方式與靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合,抑制mRNA的翻譯,從而負(fù)調(diào)控靶基因表達[16]。有研究報道,前列腺癌中miRNA-30e-5p可抑制CTHRC1表達,進而降低細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力[17]。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測表明miRNA-30e-5p能夠與USP22的mRNA結(jié)合,Western blot實驗表明骨肉瘤細(xì)胞中miRNA-30e-5p確能下調(diào)USP22的蛋白表達。初步證實miRNA-30e-5p可調(diào)控USP22表達進而抑制骨肉瘤的惡性進展。

USP22是一種新的去泛素化酶,屬于泛素水解酶蛋白質(zhì)家族的一員,能夠通過去泛素化組蛋白殘基調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。USP22最初是由Glinsky等[18]在基因微陣列的研究中發(fā)現(xiàn)的,它被認(rèn)為在許多生理和病理過程中具有重要作用,如細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤侵襲。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP22在不同類型的癌癥中異常表達,與各種癌癥患者的腫瘤復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后和治療失敗有關(guān)[19]。已有研究表明,USP22可通過調(diào)控COX-2和p53結(jié)合蛋白MDMX來促進非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[20]。此外,已有研究證實USP22在骨肉瘤中過表達,并且能夠促進骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[21]。本研究表明miRNA-30e-5p能夠靶向USP22,并負(fù)調(diào)控其表達。進一步證實miRNA-30e-5p在抑制骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

EMT是指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性,降解細(xì)胞間連接,增加細(xì)胞運動性并獲得侵襲特性,成為間充質(zhì)細(xì)胞的生物過程。EMT過程的異常激活被認(rèn)為是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,因為它增加了癌細(xì)胞的活力、侵襲性和遷移性[22]。研究發(fā)現(xiàn)EMT過程在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,靶向調(diào)控EMT過程的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有望成為骨肉瘤臨床治療的新策略[23]。本研究證實,miRNA-30e-5p能上調(diào)E-cadherin蛋白表達,下調(diào)N-cadherin蛋白表達,進而抑制EMT過程。此外,已有研究證實USP22在骨肉瘤中可以激活EMT過程[21],初步說明miRNA-30e-5p可通過USP22調(diào)控EMT過程。誠然,USP22在骨肉瘤中調(diào)控EMT過程的具體分子機制仍需在未來深入研究。

本研究首次證實miRNA-30e-5p可下調(diào)USP22表達抑制EMT過程,從而影響骨肉瘤的惡性進展,以期為骨肉瘤的臨床治療提供新的策略。