PATZ1通過(guò)激活p53依賴性途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

李秀娟,鄭雪絨,趙欣媛,張露丹,張 瑾,張建華,楊 虹,李敏敏,楊 帆

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:medicalzheng01@163.com)

宮頸癌起源于子宮頸上皮,是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是世界上最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一[1]?；熀头暖熓菍m頸癌常見(jiàn)的治療干預(yù)手段[2],一般情況下,晚期患者的預(yù)后較差,常規(guī)治療后的5年生存率約為40%[3]。因此,進(jìn)一步揭示其分子機(jī)制,開(kāi)發(fā)有效的治療策略是非常必要的。

包含POZ/BTB和AT鉤的鋅指蛋白1(PATZ1),也稱為MAZ相關(guān)因子(MAZR),鋅指肉瘤基因(ZSG)或鋅指核因子/鋅指蛋白278(ZNF278/Zfp278)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,已被證明可根據(jù)細(xì)胞環(huán)境來(lái)負(fù)向或正向調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)[4,5]。幾項(xiàng)研究表明PATZ1在癌癥中的作用[4,5],但其作為癌基因或抑癌基因的癌相關(guān)功能仍存在爭(zhēng)議。PATZ1在人惡性腫瘤中的過(guò)表達(dá)支持了其致癌作用[6,7],而其被siRNAs下調(diào)后,則分別阻止或誘導(dǎo)結(jié)直腸癌或膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)或凋亡[8]。此外,研究發(fā)現(xiàn)敲除PATZ1的小鼠患上了淋巴瘤和其他腫瘤,這表明PATZ1是淋巴瘤和其他腫瘤中潛在的腫瘤抑制因子[9]。PATZ1在宮頸癌中的表達(dá)和作用仍不清楚。因此,本研究分析了PATZ1表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞中的功能并分析宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①確診為宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌;②診斷前均未接受任何形式的腫瘤特異性治療;③在本院進(jìn)行了腫瘤組織活檢,能夠獲取可用于研究的組織樣本以及鄰近正常組織(距離腫瘤組織約5 cm)樣本。排除標(biāo)準(zhǔn):①已經(jīng)進(jìn)行了治療;②無(wú)法繼續(xù)獲得研究所需要的組織樣本。

根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入2016-12～2018-12在本院進(jìn)行了首次手術(shù)的患者中,選取20例患者的宮頸癌組織及其鄰近正常組織(距離腫瘤組織約5 cm)。患者平均年齡為(55.16±12.02)歲,范圍為35.2-68.5歲。每位患者均提供書面知情同意書。本研究由西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將樣本冷凍并保存在液氮中備用。患者臨床基線特征見(jiàn)表1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa、SiHa、Caski、ME-180 Ms751和C33A)和正常子宮頸細(xì)胞系(Ect1/E6E7)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。HeLa細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),其他細(xì)胞均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清。所有細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃,5% CO2。

通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分離PATZ1 cDNA,并將其亞克隆到pcDNA載體中以生成pcDNA-PATZ1構(gòu)建體。然后,通過(guò)Lipo3000將pcDNA-PATZ1構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HeLa、SiHa及Caski細(xì)胞中,構(gòu)建HeLa/PATZ1、SiHa/PATZ1和Caski/PATZ1作為PATZ1組,同時(shí)采用空白載體轉(zhuǎn)染HeLa、SiHa及Caski細(xì)胞構(gòu)建HeLa/CTRL、SiHa/CTRL和Caski/CTRL作為對(duì)照組。進(jìn)一步孵育48 h后,采用這些細(xì)胞進(jìn)行集落形成、細(xì)胞遷移和侵襲及動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)

表1 研究對(duì)象臨床基線特征 (例)

Table 1 Baeline of enrolled patients with cervical cancer (cases)

臨床特征納入研究者(n=20)絕經(jīng) 是8 否12組織學(xué) 鱗狀細(xì)胞癌6腫瘤大小 <4.0 cm12 >4.0 cm8淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性12 陽(yáng)性8浸潤(rùn)深度 <2/312 >2/38FIGO分期 IA2 IB12 II6

。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)定量(qRT)-PCR

為了研究PATZ1在宮頸癌腫瘤組織、正常組織及宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá),從宮頸癌組織、宮頸組織正常樣本和細(xì)胞系中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列如下。PATZ1正向:5′-TACATCTGCCAGAGCTGTGG-3′,反向:5′-TGCACCTGC TTGATATGTCC-3′;GAPDH正向:5′-GATCTACCGCATCGACCACT-3′,反向:5′-AGATCCTGTTGGCAAATCTCA-3′。

為了進(jìn)一步研究PATZ1參與介導(dǎo)細(xì)胞遷移抑制的分子機(jī)制,分析了HeLa/PATZ1、SiHa/PATZ1和Caski/PATZ1及對(duì)照組細(xì)胞中在細(xì)胞遷移過(guò)程的起關(guān)鍵作用的一組P53下游基因的表達(dá),包括EpCam,RhoE和Caldesmon。引物序列見(jiàn)表2。

表2 相關(guān)基因引物序列

Table 2 Primer sequences of related genes

基因正向引物序列 反向引物序列 EpCam5′-CCATGTGCTG GTGTGTGAA-3′5′-TGTGTTTTAGTTCAATGATGATC CA-3′Caldesmon5′-GAGCGTCGCAGAGAACTTAGA-3′5′-TCCTCTG GTAGGCGATTCTTT-3′RhoE5′-AAAAACTGCGC TGCTCCAT-3′5′-TCAAAACTGGCCGTGTAATTC-3′

1.4 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析

采用免疫印跡確定PATZ1蛋白在宮頸癌細(xì)胞系和正常宮頸細(xì)胞中的表達(dá),用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液從培養(yǎng)的正常宮頸細(xì)胞(Ect1/E6E7)及6種宮頸癌細(xì)胞系(HeLa、SiHa、Caski、ME-180、Ms751和C33A)中提取總蛋白。用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度?？偟鞍自?%-10%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳中分離,并通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜用1×TBS,0.1%Tween-20和5%BSA封閉,并與抗GAPDH、抗PATZ1抗體孵育。

1.5 集落形成分析和生長(zhǎng)活力測(cè)定

為了確定PATZ1的表達(dá)是否在宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中起作用,將pcDNA-PATZ1構(gòu)建體和空白載體轉(zhuǎn)染(對(duì)照組)的HeLa、SiHa細(xì)胞進(jìn)行了集落形成分析。將細(xì)胞以90%的密度接種在培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)兩周后,將細(xì)胞固定,并用0.1%結(jié)晶紫的20%甲醇溶液染色30 min,用PBS洗滌并拍照。為了進(jìn)一步研究生長(zhǎng)抑制的原因,對(duì)HeLa/PATZ1、SiHa/PATZ1及各自的對(duì)照進(jìn)行生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞活力測(cè)定。將細(xì)胞(4×104個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿)鋪在6 cm培養(yǎng)皿中,臺(tái)盼藍(lán)染色后通過(guò)Bürker室計(jì)數(shù),以評(píng)估細(xì)胞活力。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)

為了檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力的變化,進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),HeLa/PATZ1作為實(shí)驗(yàn)組,HeLa/CTRL作為對(duì)照組。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,并調(diào)節(jié)至5×105細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液的濃度,然后接種到6孔板中并在37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。第2天,將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,達(dá)到約95%-100%的融合度,并用20 μl針尖傷細(xì)胞單層。然后將細(xì)胞用培養(yǎng)基漂洗兩次,并孵育48 h。在0,6,24,30 h,在倒置顯微鏡下拍攝細(xì)胞。

為了更好地研究宮頸癌細(xì)胞遷移能力,采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行測(cè)定,HeLa/PATZ1、SiHa/PATZ1和Caski/PATZ1作為實(shí)驗(yàn)組,HeLa/CTRL、SiHa/CTRL和Caski/CTRL作為對(duì)照組。用胰蛋白酶/EDTA收集匯合的細(xì)胞單層,以1 200 r/min離心5 min,重懸于無(wú)血清的培養(yǎng)基中,并鋪板[(3-5)×104個(gè)細(xì)胞]至8 μm聚碳酸酯膜濾器的上腔室中。下腔室充滿了完全的培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞在37 ℃,5%CO2中孵育24 h和48 h。擦去過(guò)濾器上側(cè)的未遷移細(xì)胞,并將過(guò)濾器反側(cè)上的遷移細(xì)胞用在20%甲醇中的0.1%結(jié)晶紫染色30 min,用PBS洗滌并在光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.7 動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)

為了研究了Hela/PATZ1,SiHa/PATZ1及其對(duì)照組細(xì)胞在裸鼠中產(chǎn)生腫瘤的能力。采用6周的雌性裸鼠(購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)皮下注射對(duì)照和PATZ1轉(zhuǎn)染的HeLa和SiHa細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞)來(lái)評(píng)估體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況(每組8只)。每3 d測(cè)量一次腫瘤體積,計(jì)算公式為:體積=長(zhǎng)×(寬/2)2。3周后處死所有小鼠進(jìn)行腫瘤質(zhì)量測(cè)定和分離。小鼠實(shí)驗(yàn)得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 PATZ1在宮頸癌臨床腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)

20例宮頸癌標(biāo)本PATZ1的mRNA表達(dá)水平明顯低于相鄰正常組織樣本(見(jiàn)圖1A)。與宮頸正常細(xì)胞(Ect1/E6E7)相比,宮頸癌細(xì)胞系PATZ1蛋白表達(dá)水平明顯降低(見(jiàn)圖1B)。此外,與宮頸正常細(xì)胞系(Ect1/E6E7)相比,宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、ME-180、Ms751、C33A中PATZ1 mRNA表達(dá)水平顯著降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),SiHa細(xì)胞中PATZ1 mRNA表達(dá)水平也顯著降低(P<0.001,見(jiàn)圖1C)。

圖1 PATZ1在宮頸癌腫瘤組織和正常組織及宮頸細(xì)胞系中表達(dá)結(jié)果Figure 1 PATZ1 expression in cervical cancer cell lines and tissues

2.2 PATZ1表達(dá)抑制HeLa和SiHa細(xì)胞集落的生長(zhǎng)

與對(duì)照組相比,PATZ1組HeLa和SiHa細(xì)胞中檢測(cè)到集落數(shù)明顯降低(見(jiàn)圖2)。與對(duì)照組相比,PATZ1組HeLa和SiHa細(xì)胞分別顯示出較低的增殖能力,分別在細(xì)胞培養(yǎng)7 d或5 d時(shí)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)。

與CTRL組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 PATZ1轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞集落生長(zhǎng)分析結(jié)果Figure 2 Cell growth in PATZ1-transfected cervical cancer cells

2.3 PATZ1表達(dá)抑制HeLa和SiHa細(xì)胞遷移和侵襲

與HeLa/CTRL對(duì)比,HeLa/PATZ1的遷移能力顯著降低(見(jiàn)圖3),表明PATZ1可以抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移。接種后24 h,所有轉(zhuǎn)染PATZ1的HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞侵襲速度都小于對(duì)照組細(xì)胞(見(jiàn)圖4),結(jié)果表明,PATZ1在抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲性中具有關(guān)鍵作用。

圖3 PATZ1表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞遷移Figure 3 PATZ1 inhibits cell migration of HeLa cells

圖4 PATZ1表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲結(jié)果Figure 4 PATZ1 inhibits cell invasion of HeLa,SiHa and CaSki cells

2.4 PATZ1表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的致瘤性

接種空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的小鼠和接種HeLa/PATZ1,SiHa/PATZ1細(xì)胞的8只小鼠中均觀察到腫瘤生長(zhǎng)。與對(duì)照組產(chǎn)生的腫瘤相比,PATZ1組腫瘤大小和腫瘤質(zhì)量明顯減小(見(jiàn)圖5)。此外與對(duì)照組比,HeLa/PATZ1、SiHa/PATZ1組中腫瘤體積較小,分別在第9天和12天兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

2.5 PATZ1表達(dá)對(duì)p53途徑下游基因EpCam， RhoE和Caldesmon表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,與CTRL組相比,PATZ1組三種細(xì)胞系中EpCam表達(dá)下調(diào),RhoE和Caldesmon的表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)圖6),以上結(jié)果表明,在HeLa、SiHa和Caski細(xì)胞中均存在功能性P53蛋白,至少存在EpCam、Caldesmon和RhoE啟動(dòng)子且其活性可被PATZ1增強(qiáng),PATZ1與p53協(xié)同作用,抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

與各自對(duì)應(yīng)的CTRL組比較,*P<0.05圖5 PATZ1表達(dá)抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果Figure 5 PATZ1 expression inhibits tumor growth in mice

與CTRL組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 不同腫瘤細(xì)胞系中PATZ1表達(dá)對(duì)EpCam， RhoE和Caldesmon表達(dá)的影響Figure 6 Effect of PATZ1 expression on EpCam, RhoE and Caldesmon expression in different cervical cancer cell lines

3 討論

本研究結(jié)果表明,PATZ1在人宮頸癌腫瘤中的表達(dá)水平低于鄰近正常組織樣本,宮頸癌細(xì)胞中PATZ1表達(dá)水平也低于正常宮頸細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染PATZ1的宮頸癌細(xì)胞中細(xì)胞增殖和遷移、集落形成和小鼠腫瘤增殖被抑制。與CTRL組細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤相比,PATZ1組腫瘤大小、腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量降低。此外,與CTRL組細(xì)胞相比,PATZ1組三種宮頸癌細(xì)胞系中EpCam表達(dá)下調(diào),RhoE和Caldesmon的表達(dá)上調(diào)。宮頸癌細(xì)胞中PATZ1表達(dá)激活了p53依賴性途徑,該途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。

已有研究表明,PATZ1和p53之間存在功能性相互作用[10],p53維持轉(zhuǎn)錄程序通過(guò)下調(diào)基因(例如EpCam)來(lái)阻止上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),EMT可促進(jìn)遷移并侵襲周圍組織,從而引起局部和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。而下調(diào)的基因可抑制參與穩(wěn)定細(xì)胞-細(xì)胞連接的分子(例如E-鈣黏蛋白),或直接抑制黏附機(jī)制的成分(如纖連蛋白)的表達(dá)[11]。p53調(diào)控的基因還包括與抑制足小體形成有關(guān)的分子,例如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Caldesmon,它被p53上調(diào)[12]。此外,p53還可以上調(diào)控制肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的分子,例如RhoE,其在抑制伴隨腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞骨架變化中發(fā)揮作用[11]。因此本研究分析了在細(xì)胞遷移過(guò)程的起關(guān)鍵作用的一組p53下游基因的表達(dá),包括EpCam,RhoE和Caldesmon。結(jié)果表明,與對(duì)照組比,PATZ1組宮頸癌細(xì)胞EpCam表達(dá)下調(diào),Caldesmon和RhoE表達(dá)均上調(diào),和目前已有研究結(jié)論一致。

EMT參與許多生物過(guò)程,包括胚胎發(fā)育、傷口愈合和癌癥進(jìn)展[13,14]。越來(lái)越多研究表明,EMT在許多類型的癌癥轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)中起重要作用[15,16]。因此,鑒定調(diào)節(jié)這些細(xì)胞過(guò)程的基因?qū)τ诎邢虬┌Y治療具有巨大的潛力。對(duì)抗EMT的主要參與者之一是抑癌P53蛋白,其丟失已被證明會(huì)影響癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[17]。

此外,最近研究表明PATZ1能夠與p53相互作用并直接調(diào)節(jié)p53調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[18],表明PATZ1可能參與EMT的機(jī)制。一致地，本研究發(fā)現(xiàn)PATZ1表達(dá)導(dǎo)致p53調(diào)控基因(EpCam， RhoE和Caldesmon)表達(dá)發(fā)生變化。后續(xù)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)更好地闡明PATZ1在不同細(xì)胞系中與這些基因結(jié)合的動(dòng)態(tài)，以及與功能性P53蛋白存在的關(guān)系。

總之,本研究結(jié)果表明PATZ1通過(guò)調(diào)節(jié)p53靶基因在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用,減少了宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移以及體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。