前列腺癌干細胞CD147的表達及與患者細胞免疫水平的相關(guān)性

李蘇亮,劉 冰,袁小華,相 蓮,王雨琛,葉 蕓

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:yeyun236@163.com)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性泌尿系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤之一,在歐美人群中的發(fā)病率高居首位,死亡率僅次于肺癌[1,2]。亞洲地區(qū)被認為是前列腺癌低發(fā)區(qū),但隨著我國人口老齡化的發(fā)展以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[3]。目前臨床選用的前列腺特異性抗原(PSA)等標志物的敏感性和特異性較差,難以滿足臨床需要[4]。因此,選擇具有高敏感性和特異性的腫瘤標志物對于PCa的診斷和治療具有重要意義。CD147作為免疫球蛋白家族的一員,在多種腫瘤細胞表面表達[5,6]。CD147通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的合成,以不同的方式參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。研究表明CD147可能與PCa的發(fā)病機制密切相關(guān)[8],但是關(guān)于前列腺癌干細胞CD147的表達情況及CD147與細胞免疫水平之間的關(guān)系仍需進一步研究。因此,本研究選擇2016-03～2019-06入院的60例前列腺癌患者作為對象,探討CD147在前列腺癌干細胞中的表達及其與患者細胞免疫水平之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016-03～2019-06西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者和未轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者各30例,患者一般資料見表1。術(shù)中收集患者的腫瘤組織,兩組人群均空腹采集靜脈血5 ml,室溫靜置30 min,3 000g離心15 min分離血清,-80 ℃凍存。本研究得到西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 納入患者的一般資料

Table 1 Characteristics of the included patients

轉(zhuǎn)移組未轉(zhuǎn)移組χ2P年齡0.2870.592 <70歲1012 ≥70歲2018PSA4.040.040 <10 ng/ml217 ≥10 ng/ml813Gleason評分11.380.001 <81023 ≥8207臨床分期15.4290.001 T1/T2520 T3/T42510

1.2 前列腺癌干細胞的分離培養(yǎng)

所有患者均行手術(shù)治療,取前列腺癌癌病灶組織,采用差速離心法完成細胞分離。具體方法如下:將其放在含有10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中浸泡5 min,PBS反復(fù)沖洗后去除脂肪等組織,利用10 ml注射器抽取含有10.0%胎牛血清的培養(yǎng)基,4 500 r/min離心20 min,結(jié)束后用吸管輕輕吹打細胞,加入10 ml生理鹽水進行重懸沉淀。對懸液再次離心,500 r/min離心5 min,加入10 ml生理鹽水,以1.0×106/ml密度接種在培養(yǎng)瓶中,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。

1.3 CD147陽性表達細胞數(shù)的測定

根據(jù)細胞的形態(tài)、生長曲線及流式細胞結(jié)果完成腫瘤干細胞鑒定[9]。取采集的前列腺癌干細胞,4 000 r/min離心15 min,采用流式細胞儀測定兩組細胞中表達CD147的細胞數(shù)。取上述分離、制備的干細胞2×106/ml,加入24孔培養(yǎng)板中,將其放置在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別加入10 ml CD3-APC和CD4-FITC抗體,室溫避光孵育30 min。洗滌后去除上清液,4%多聚甲醛進行固定,放置20 min。0.1%皂素進行10 min穿膜,去除上清液后每管留穿膜液重懸細胞200 μl;向?qū)嶒灩苤屑尤?0 μl Foxp3抗體,避光孵育1 h,洗滌后穿膜液重懸細胞500 μl后放入流式細胞儀上測定。

1.4 細胞因子檢測

兩組患者分別取空腹靜脈血5ml,4 500 r/min離心15 min,血清分離完畢后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(INF-γ)水平、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-6(IL-6),操作步驟均按照試劑盒說明書完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌干細胞鑒定

倒置顯微鏡下前列腺癌干細胞接種在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,細胞生長曲線顯示細胞第3天進入對數(shù)增長期,第9天進入平臺期。流式細胞儀測定結(jié)果表明:前列腺癌干細胞表面標志物CD133+細胞群含量達到83.2%(見圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組CD147表達水平比較

轉(zhuǎn)移組CD147陽性表達率33.7%(10/30),未轉(zhuǎn)移組CD147陽性表達率6.7%(2/30),兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.667,P=0.01)。

2.3 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組炎癥因子水平比較

轉(zhuǎn)移組IL-2和INF-γ水平高于未轉(zhuǎn)移組,轉(zhuǎn)移組IL-10和IL-6水平低于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05,見表2)。

2.4 CD147的表達與細胞免疫水平相關(guān)性分析

轉(zhuǎn)移組患者CD147的表達與IL-2和INF-γ水平呈正相關(guān),但與IL-10和IL-6呈負相關(guān)(均P<0.05,見表3)。

A.倒置顯微鏡結(jié)果 B.細胞生長曲線C.流式細胞術(shù)檢測CD133的表達圖1 前列腺癌干細胞的鑒定Figure 1 Identification of prostate cancer stem cells

表2 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組炎癥因子水平比較

Table 2 Comparison of inflammatory factor levels between metastatic and non-metastatic prostate cancer patients

分組nIL-2(ng/L)INF-γ(μg/L)IL-10(ng/L)IL-6(ng/L)轉(zhuǎn)移組 30 376.53±13.4833.48±4.7251.78±13.3773.39±8.71未轉(zhuǎn)移組30 137.13±6.7323.31±3.41142.73±14.56156.78±11.86t13.53 15.7611.3810.65P0.0010.0010.0010.001

表3 CD147的表達與細胞免疫水平相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis of CD147 expression and the level of cellular immunity

統(tǒng)計參數(shù)CD147與IL-2CD147與INF-γCD147與IL-10CD147與IL-6轉(zhuǎn)移組未轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移組未轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移組未轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移組未轉(zhuǎn)移組r0.4810.2530.6720.189-0.516-0.207-0.768-0.154P0.0180.1650.0230.2080.0190.1270.0120.196

3 討論

2005年,Collins等[9]首次從前列腺癌組織中分離出腫瘤干細胞,其增殖和分化能力遠大于其他前列腺腫瘤細胞,并可在雄激素缺乏條件下存活。腫瘤干細胞與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),該細胞不同于普通癌細胞,具有自我更新、無限分化潛能,是前列腺癌治療失敗的根本原因[10]。前列腺癌的發(fā)生、常伴有機體免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞之間的相互作用,免疫系統(tǒng)通過重塑腫瘤細胞抗原性,影響機體免疫功能的正常發(fā)揮[11]。本研究從前列腺癌組織中分離獲得前列腺癌干細胞,前列腺癌干細胞表面標志物CD133+細胞群含量達到83.2%;細胞生長曲線顯示細胞第3天進入對數(shù)增長期,第9天進入平臺期;流式細胞儀測定結(jié)果進一步確定本研究分離制備的干細胞為前列腺癌干細胞,能為本研究下一步實驗的進行奠定基礎(chǔ)。

CD147是屬于免疫球蛋白超家族的一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，其主要功能包括參與細胞間或者細胞和基質(zhì)之間的黏附作用[12]。同時,CD147表達于所有的淋巴細胞表面,參與淋巴細胞的分化,作為細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的誘導(dǎo)劑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)CD147是腫瘤預(yù)后的指標,其可增強基質(zhì)金屬蛋白酶活性進而促進癌細胞遷移、入侵和轉(zhuǎn)移,實現(xiàn)腫瘤細胞的自我更新并有助于腫瘤干細胞繼續(xù)生長、發(fā)展[15]。CD147介導(dǎo)的糖酵解代謝可能在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫逃逸,通過免疫機制逃避機體的免疫監(jiān)視,從而提高了免疫耐受作用[16]。本研究中,轉(zhuǎn)移性前列腺癌組CD147陽性表達率33.7%,未轉(zhuǎn)移組CD147陽性表達率6.7%,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展常伴有免疫水平的變化及炎癥因子的共同參與[17]。根據(jù)分泌細胞因子不同將輔助性T淋巴細胞分為Th0、Th1、Th2及Th3四種不同的類型,而在人體中主要以Th1、Th2為主[18]。Th1細胞主要分泌IL-2和INF-γ等,能介導(dǎo)細胞毒作用,其表達水平與機體局部免疫應(yīng)答有關(guān),能輔助相關(guān)抗體的生成,直接參與細胞免疫。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等炎癥因子,其表達水平多與體液免疫水平有關(guān)。Th1與Th2處于一個動態(tài)平衡,共同維持機體細胞免疫與體液免疫[19]。但是,前列腺癌患者由于癌細胞的持續(xù)增殖、生長,導(dǎo)致機體的免疫平衡被打破。本研究中,轉(zhuǎn)移組IL-2和INF-γ水平高于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05);而轉(zhuǎn)移組IL-10和IL-6水平低于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。進一步提示前列腺癌患者中伴有免疫水平失衡且與轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究中進一步分析了CD147的表達水平與前列腺癌患者細胞免疫水平的關(guān)系,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移性前列腺癌CD147在干細胞中表達與IL-2和INF-γ水平呈正相關(guān)性,而與IL-10和IL-6水平呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果說明轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者腫瘤干細胞CD147高表達進而促進Th1細胞活性導(dǎo)致機體細胞免疫與體液免疫失衡。80%-90%的前列腺癌患者晚期均有不同程度的轉(zhuǎn)移,約50%的轉(zhuǎn)移患者在確診后30-35個月內(nèi)死亡。因此,前列腺癌患者的CD147及細胞免疫水平的定期監(jiān)測可有助于及時判斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生與否并采取有效的措施進行治療、干預(yù)。

綜上所述,CD147在轉(zhuǎn)移性前列腺患者的PCa干細胞中呈高表達,且與患者細胞免疫水平具有相關(guān)性。CD147表達水平及患者細胞免疫水平相關(guān)指標的檢測對前列腺癌的病情判定及治療、預(yù)后評估具有一定的臨床指導(dǎo)價值。