lncRNA RP13-991F5.2通過調(diào)控LKB1/AMPK信號通路抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和增殖

胡 波,劉詩月,黃玉琴,咼 月

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科,襄陽 441000;*通訊作者,E-mail:hb20054291@126.com)

腎細(xì)胞癌起源于腎小管上皮細(xì)胞,大約占成人惡性腫瘤的2%,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。腎細(xì)胞癌早期易轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅患者的生命健康[2]。腎細(xì)胞癌對放射治療、化學(xué)治療均不敏感,其主要治療方式仍是手術(shù)治療,但復(fù)發(fā)率較高[3]。探究腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制,對腎細(xì)胞癌的靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳水平等方面對基因表達(dá)具有調(diào)控作用[4]。近年的研究表明,lncRNA在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中具有類似癌基因或抑癌基因的作用[5]。lncRNA是近年來腎細(xì)胞癌研究領(lǐng)域一個新的熱點。RP13-991F5.2是一個尚未被報道的lncRNA,長度為838 nt。本研究檢測了RP13-991F5.2在83對腎細(xì)胞癌組織和癌旁組織、腎細(xì)胞癌細(xì)胞株和正常腎小管上皮細(xì)胞中的差異表達(dá),通過在表達(dá)最低的腎細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)RP13-991F5.2,觀察RP13-991F5.2對腎細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響,并探討其分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源

83對腎細(xì)胞癌組織和對應(yīng)的癌旁組織為湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科2016-11～2019-04手術(shù)切除的標(biāo)本,以距離腫瘤邊緣5 cm處的組織為癌旁組織,采集后立即于液氮中保存?；颊咝g(shù)前均未接受放射治療和化學(xué)治療。所有腎細(xì)胞癌組織和癌旁組織均經(jīng)病理學(xué)證實。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會批注,患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;腎細(xì)胞癌細(xì)胞株(ACHN、A498、OS-RC-2、786-O、Caki-1)和正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購于上海信然生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;陰性對照慢病毒、攜帶RP13-991F5.2的慢病毒購于南京諾唯贊生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司;一抗mTORC2、LKB1、GAPDH、AMPK、Raptor及p-Raptor購于美國Abcam公司;Transwell小室購于美國Corning公司;基質(zhì)膠購于美國Life Technologies公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中,5種腎細(xì)胞癌細(xì)胞株均利用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),正常腎小管上皮細(xì)胞利用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代。接種對數(shù)生長期Caki-1細(xì)胞至6孔板,細(xì)胞匯合度為40%時感染慢病毒。慢病毒感染步驟嚴(yán)格依據(jù)說明書操作,分別感染攜帶RP13-991F5.2的慢病毒和陰性對照慢病毒(感染復(fù)數(shù)均為25),定義為RP13-991F5.2組和對照組。慢病毒感染Caki-1細(xì)胞12 h后,觀察細(xì)胞狀態(tài),及時更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測RP13-991F5.2和LKB1 mRNA的表達(dá)量

選取200 mg組織或細(xì)胞,利用Trizol試劑提取總RNA,利用紫外分光儀分析其濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,采用qPCR檢測RP13-991F5.2和LKB1 mRNA的相對表達(dá),所得數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt方法計算。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃變性10 s,62 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共35個循環(huán)。以GAPDH作內(nèi)參,計算RP13-991F5.2和LKB1的表達(dá)量。RP13-991F5.2上游引物:5′-CGCCTCTAATCCCAGCTACTT-3′,下游引物:5′-CACCTCCCAGGTTCAAGC-3′;LKB1上游引物:5′-TGTCGG TGGGTATGGACAC-3′,下游引物:5′-CCTTGCCGTAAGAGCCTTCC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.5 Transwell侵襲實驗檢測感染Caki-1細(xì)胞的侵襲能力

預(yù)先將基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell上室,在培養(yǎng)箱中凝固。收集感染后48 h的Caki-1細(xì)胞,無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度。每組均加200 μl細(xì)胞懸液至上室,下室均加入700 μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,利用4%多聚甲醛室溫下固定10 min,利用0.1%結(jié)晶紫染液室溫下染色15 min。流水沖洗染液后,棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞。在高倍顯微鏡下,計數(shù)每組穿過底膜的細(xì)胞數(shù),表示Caki-1細(xì)胞的侵襲能力。

1.6 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測感染Caki-1細(xì)胞的增殖能力

收集感染48 h的Caki-1細(xì)胞,RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后,以4 000個/孔接種于96孔板,分別于接種細(xì)胞后的第1-5天進(jìn)行MTT檢測。檢測時,加入23 μl/孔MTT試劑,培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,加入180 μl/孔二甲基亞砜,充分振蕩后,利用酶標(biāo)儀檢測在波長495 nm處每孔的吸光度(A)值。

1.7 Western blot檢測LKB1/AMPK信號通路蛋白的表達(dá)

收集感染后48 h的Caki-1細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,每組細(xì)胞蛋白上樣量為40 μg,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,利用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。在室溫下,PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別孵育LKB1(稀釋比為1 ∶1 000)、AMPK(稀釋比為1 ∶1 000)、Raptor(稀釋比為1 ∶3 000)、p-Raptor(稀釋比為1 ∶2 000)、mTORC2(稀釋比為1 ∶2 000)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000),4 ℃下孵育過夜。室溫下孵育二抗2 h后,均勻滴加超敏ECL發(fā)光試劑,利用凝膠成像儀顯影、拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎細(xì)胞癌組織中RP13-991F5.2的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,83對腎細(xì)胞癌組織和癌旁組織中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量分別為1.34±0.26和6.72±0.98,癌旁組織RP13-991F5.2的相對表達(dá)量是腎細(xì)胞癌組織的5.01倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.31,P<0.01,見圖1)。

2.2 腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中RP13-991F5.2的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,腎細(xì)胞癌細(xì)胞株(ACHN、A498、OS-RC-2、786-O、Caki-1)和正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量分別為0.51±0.05,0.77±0.02,0.47±0.02,0.30±0.03,0.14±0.02和1.01±0.09,腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量明顯低于正常腎小管細(xì)胞(P<0.05),Caki-1細(xì)胞中的表達(dá)最低(P<0.01,見圖2)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 腎細(xì)胞癌組織和癌旁組織中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量Figure 1 Expression of RP13-991F5.2 in bladder cancer tissues and paracancerous tissues

與HK-2細(xì)胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 腎細(xì)胞癌細(xì)胞株和正常腎小管上皮細(xì)胞中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量Figure 2 Expression of RP13-991F5.2 in bladder cancer cell lines and normal renal tubular epithelial cells

2.3 Caki-1細(xì)胞感染RP13-991F5.2病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對照組和RP13-991F5.2組細(xì)胞中RP13-991F5.2的相對表達(dá)量分別為1.01±0.07和13.90±1.51,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.54,P<0.01,見圖3)。RP13-991F5.2組RP13-991F5.2的相對表達(dá)量是對照組的13.76倍。

與對照組比較,**P<0.01圖3 Caki-1細(xì)胞感染攜帶RP13-991F5.2的慢病毒和陰性對照慢病毒后RP13-991F5.2的相對表達(dá)量Figure 3 Expression of RP13-991F5.2 in Caki-1 cells infected with the lentivirus carrying RP13-991F5.2 or the negative control

2.4 RP13-991F5.2對Caki-1細(xì)胞侵襲能力的影響

對照組和RP13-991F5.2組細(xì)胞中穿膜Caki-1細(xì)胞數(shù)分別為(109.70±15.37)個和(40.60±7.06)個。與對照組比較,RP13-991F5.2組穿膜Caki-1細(xì)胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.09,P<0.01,見圖4),RP13-991F5.2具有抑制腎細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞侵襲的能力。

與對照組相比,**P<0.01圖4 RP13-991F5.2對Caki-1細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of RP13-991F5.2 on the invasion ability of Caki-1 cells

2.5 RP13-991F5.2對Caki-1細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,兩組Caki-1細(xì)胞在感染后第1天的A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.22,P>0.05,見圖5)。RP13-991F5.2組Caki-1細(xì)胞在感染后第2,3,4,5天的A值低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別t=3.86,P<0.05;t=4.12,P<0.05;t=4.73,P<0.01;t=4.79,P<0.01),表明RP13-991F5.2具有抑制腎細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞增殖的能力。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖5 RP13-991F5.2對Caki-1細(xì)胞增殖能力的影響Figure 5 Effect of RP13-991F5.2 on the proliferation of Caki-1 cells

2.6 Caki-1細(xì)胞感染RP13-991F5.2慢病毒對LKB1 mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,RP13-991F5.2組Caki-1細(xì)胞感染RP13-991F5.2慢病毒后LKB1 mRNA的相對表達(dá)量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(6.77±1.24vs1.01±0.09,t=13.80,P<0.01),表明RP13-991F5.2可有效促進(jìn)LKB1 mRNA的相對表達(dá)。

2.7 Caki-1細(xì)胞感染RP13-991F5.2慢病毒后LKB1/AMPK信號通路蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明,RP13-991F5.2組Caki-1細(xì)胞感染RP13-991F5.2慢病毒后,LKB1和AMPK蛋白表達(dá)量明顯升高(見圖6),表明LKB1/AMPK信號通路可能被活化。同時,p-Raptor蛋白和mTORC2蛋白表達(dá)降低,表明mTOR信號通路可能被抑制。

圖6 RP13-991F5.2對LKB1/AMPK信號通路蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of RP13-991F5.2 on the expression of LKB1/AMPK signaling pathway proteins

3 討論

人類基因組轉(zhuǎn)錄后的大部分RNA均不能翻譯為蛋白,僅有2%的RNA可編碼蛋白,長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是非編碼RNA的重要組成部分[6]。很長一段時間,由于lncRNA缺乏開放閱讀框,研究者認(rèn)為lncRNA只是轉(zhuǎn)錄的“副產(chǎn)物”,不具有生物學(xué)意義[7]。越來越多的研究表明,lncRNA可直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶、染色質(zhì)修飾蛋白,引導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,參與細(xì)胞的分化、發(fā)育、凋亡等活動[8,9]。近年來,很多l(xiāng)ncRNA被證實在包括腎細(xì)胞癌在內(nèi)的腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)存在明顯異常,其表達(dá)水平與患者腫瘤大小、TNM分期、預(yù)后情況相關(guān)[10,11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA KCNQ1DN在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)明顯降低,其低表達(dá)可能源于啟動子的高度甲基化,KCNQ1DN可通過抑制癌基因c-myc的表達(dá),顯著抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長。Shi等[13]發(fā)現(xiàn),lncRNA ROR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),主要通過調(diào)節(jié)miR-206/VEGF分子軸促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展,沉默lncRNA ROR表達(dá)可顯著抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Luo等[14]發(fā)現(xiàn),lncRNA ENST00000434223的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān),下調(diào)ENST00000434223表達(dá)可增強腎細(xì)胞癌細(xì)胞的活力和侵襲性,過表達(dá)ENST00000434223可明顯抑制細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力,ENST00000434223發(fā)揮作用的機制可能與Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。lncRNA對腎細(xì)胞癌的診斷和靶向治療具有重要臨床意義。RP13-991F5.2是一種尚未被報道的lncRNA,其在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)和分子作用機制尚不明確。

本研究以RP13-991F5.2作為研究對象,通過qPCR法驗證其在腎細(xì)胞癌和細(xì)胞株中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,RP13-991F5.2在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)降低;與正常腎小管上皮相比RP13-991F5.2在腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)降低,表明RP13-991F5.2可能在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究進(jìn)一步將載有RP13-991F5.2的慢病毒感染腎細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞,通過Transwell侵襲實驗和MTT法檢測過表達(dá)RP13-991F5.2后Caki-1細(xì)胞的侵襲和增殖能力。結(jié)果顯示,過表達(dá)RP13-991F5.2可明顯抑制腎細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力,提示RP13-991F5.2可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生長。肝激酶B1(LKB1)基因包括1個非編碼外顯子和9個編碼外顯子,其蛋白由433個氨基酸組成,可調(diào)節(jié)細(xì)胞極性,是一種腫瘤抑制因子[15]。在人體大部分組織中,LKB1均有表達(dá),其表達(dá)異常在疾病尤其是腫瘤的發(fā)生中具有重要作用,LKB1表達(dá)缺失或突變在越來越多的多種惡性腫瘤如前列腺癌、肝癌被證實參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[16,17]。有研究表明,LKB1在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá),LKB1表達(dá)降低與腎細(xì)胞癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和異常增殖明顯相關(guān)[18]。qPCR和Western blot顯示,過表達(dá)RP13-991F5.2在mRNA和蛋白水平上均可明顯促進(jìn)LKB1基因的表達(dá)。LKB1主要通過活化LKB1/AMPK信號通路,抑制Raptor蛋白磷酸化,進(jìn)而抑制mTOR信號通路活化,從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長,發(fā)揮抑癌基因的作用[19]。RP13-991F5.2促進(jìn)LKB1蛋白表達(dá)后,AMPK蛋白表達(dá)升高,p-Raptor蛋白和mTORC2蛋白表達(dá)降低,表明LKB1/AMPK信號通路被活化,mTOR信號通路被抑制。RP13-991F5.2可能主要通過促進(jìn)LKB1/AMPK信號通路活化,參與抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

綜上所述,腎細(xì)胞癌組織中RP13-991F5.2呈低表達(dá),上調(diào)RP13-991F5.2明顯抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。RP13-991F5.2可能是通過促進(jìn)LKB1/AMPK信號通路的活化在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用,可能成為腎細(xì)胞癌的基因治療靶點。