糖尿病大鼠骨髓干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性：對照研究

王蕾 陳旭濤 丁鋒 王悅 宋應(yīng)亮

糖尿病的高血糖毒性，異常胰島素及細(xì)胞因子水平、氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致了以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征糖尿病性骨質(zhì)疏松的形成[1-2]。同時，糖尿病患者骨折風(fēng)險增加，骨折愈合能力顯著降低[3]，糖尿病患者種植體的早期骨結(jié)合受到影響[4]。近年來，組織工程技術(shù)利用間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新，多向分化等優(yōu)勢，來提高糖尿病患者的成骨能力。自體干細(xì)胞由于臨床易得及無免疫排斥的優(yōu)點，成為理想的種子細(xì)胞。其中，BMSCs及ADSCs得到最廣泛的應(yīng)用[5-6]。但對于糖尿病患者，干細(xì)胞的生物性能有所改變[7-8]，選擇最適宜的自體干細(xì)胞作為糖尿病患者骨再生的種子細(xì)胞也成為應(yīng)用熱點。本研究通過比較糖尿病大鼠來源的ADSCs和BMSCs基本生物學(xué)特性，以期為之后的相關(guān)研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

MEM Alpha培養(yǎng)基(HyClone，美國)；胎牛血清(BI，以色列)；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)； 油紅O(Sigma，美國)； 堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)； 天狼猩紅染色液、茜素紅染色液，結(jié)晶紫染色液(Solaibio?， 北京索萊寶)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN?, 天根生化科技(北京)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Takara，日本)；細(xì)胞孵箱(Thermo，美國)；顯微鏡(OLYMPUS，陜西華大生物公司)。

1.2 糖尿病模型建立

取10只SPF級8周齡SD雄性大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為:糖尿病組(n=6)和正常對照組(n=4)。糖尿病組:高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周后，以30 mg/kg劑量的STZ行腹腔注射。 1 周后尾尖取血，測血糖，以隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L為建模成功。正常對照組:普通飼料喂養(yǎng)，并在4 周時行等量檸檬酸緩沖液注射。

1.3 干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

ADSCs的分離及培養(yǎng)：選建模成功4 周后的糖尿病大鼠，過量麻藥處死。無菌條件下取腹股溝處的脂肪組織，膠原酶消化法提取ADSCs， 37 ℃、 5% CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。之后每3 d換液至細(xì)胞匯合達(dá)80%時傳代。

BMSCs的分離和培養(yǎng)：無菌條件取大鼠雙側(cè)下肢骨。注射器吸取完全培養(yǎng)基，深入骨髓腔內(nèi)反復(fù)沖洗至其內(nèi)發(fā)白，收集細(xì)胞懸液，離心重懸后接種， 37 ℃、 5% CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。之后每3 d換液1 次，至細(xì)胞匯合達(dá)80%進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞克隆及增殖活性檢測

克隆形成率測定：將P3代細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞數(shù)為1 000 個/皿。 10 d后多聚甲醛固定，0.1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，顯微鏡下觀察，計數(shù)并拍照。計算細(xì)胞克隆形成率。

CCK-8檢測細(xì)胞活力：將P3的細(xì)胞以5 000/孔的密度接種于96 孔板，每天設(shè)為1 組，每組4 個復(fù)孔，并設(shè)2 個對照孔。每天于同一時間按照10∶1的比例在待測組加入培養(yǎng)基和CCK8混合物110 μl， 37 ℃、 5% CO2的條件下孵育3 h，后吸取懸液100 μl于新的96 孔板， 測450 nm波長處的吸光度值(A值)，繪制生長曲線。

1.5 多向分化能力檢測

1.5.1 成脂分化 選P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，更換成脂誘導(dǎo)液。14 d后，多聚甲醛固定,油紅O染色,顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2 成骨分化 選P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，更換成骨誘導(dǎo)液。

ALP染色：誘導(dǎo)7 d后固定，ALP室溫避光孵育30 min，PBS洗滌終止顯色反應(yīng)。半定量分析：使用ImageJ軟件，選取多個視野，設(shè)置相同閾值，比較染色區(qū)占總視野比值，定量對比。

天狼猩紅染色：誘導(dǎo)14 d后固定，1%天狼猩紅染色18 h， 0.1 mol/L醋酸洗去多余染液，鏡下拍照。半定量分析：每孔加入1 ml 0.2 mol/L NaOH/甲醇(1∶1)洗脫液， 在540 nm波長處吸光度值并比較。

茜素紅染色：誘導(dǎo)28 d后固定。0.1%茜素紅染液室溫避光孵育2～3 min至顯色，鏡下觀察拍照。半定量分析：加入1 ml氯化十六烷吡啶洗脫液,置于搖床緩慢搖動2 h， 比較兩者在620 nm波長處吸光度值。

1.6 成骨相關(guān)基因?qū)Ρ?/h3>

成骨誘導(dǎo)3、 7、 14 d， 提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)。具體操作步驟參考TIABGEN?及TAKARA?試劑盒說明書，引物由北京奧科生物合成(表 1)。

表1 qPCR引物序列

1.7 膜片電鏡及HE對比

常規(guī)培養(yǎng)2 組細(xì)胞匯合至90%，更換成膜誘導(dǎo)液(含50 μg/ml抗壞血酸)。 10 d后取膜片進(jìn)行HE染色和電鏡觀察。利用PS軟件測量膜片厚度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析， 2 組比較采用成組t檢驗，不同時間兩組比較采用多因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病建模結(jié)果

成模后，糖尿病組隨機(jī)血糖穩(wěn)定維持大于16.7 mmol/L(表 2), 2 組大鼠血糖值具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)第2 天，見少量ADSCs細(xì)胞貼壁， 第4～5 天細(xì)胞密度可達(dá)80%。BMSCs于第3 天開始貼壁， 7～8 d細(xì)胞密度可達(dá)80%。細(xì)胞形態(tài)多為長梭形，多角形或星形(圖 1)。

2.3 克隆形成率及生長曲線測定

細(xì)胞在接種后第10 天，均形成大量細(xì)胞克隆。ADSCs和BMSCs克隆形成率分別為35.67%和25.67%， 2 種干細(xì)胞之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖 2)。

表 2 糖尿病和正常大鼠血糖值比較Tab 2 Comparison of blood glucose values between diabetic and normal rats (mmol/L，

圖1 ADSCs及BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 (倒置顯微鏡，×40) 圖 2 細(xì)胞克隆形成率和增殖曲線(*:P<0.05; **:P<0.01)

Fig 1 The morphology of AD SCs and BMSCs Fig 2 Clone formation rate and growth cure of ADSCs and BMSCs (Inverted microscope, ×40) (*:P<0.05; **:P<0.01)

細(xì)胞均形成顯著的S形生長曲線。第一天細(xì)胞生長處于滯留期。自第2 天起進(jìn)入對數(shù)生長期，第7 天到達(dá)平臺期。ADSCs的增殖速率于第3 天后逐漸高于BMSCs,在第4、 5、 7 天時相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖 2)。

2.5 多向分化能力檢測

2.5.1 成脂分化 2 組細(xì)胞均可產(chǎn)生脂滴，脂滴融合為串珠樣。ADSCs形成的脂滴數(shù)量多且體積較大；BMSCs形成的數(shù)量少且較小(圖 3)。證實2 種細(xì)胞均可定向成脂分化。

2.5.2 成骨分化 ALP染色及定量: 細(xì)胞均呈藍(lán)紫色著色，BMSCs中ALP的表達(dá)量明顯高于ADSCs(圖 3)。通過ImageJ軟件進(jìn)行兩樣本中多個視野染色面積對比，統(tǒng)計分析顯示兩種細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

天狼猩紅染色及定量： ADSCs呈現(xiàn)粗大的膠原束，而BMSCs形成的膠原較為細(xì)小(圖 3)。定量結(jié)果表明:ADSCs的膠原分泌量高于BMSCs， 2 種細(xì)胞的染色結(jié)果相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。

茜素紅染色及定量： BMSCs有更多的礦化結(jié)節(jié)形成，少量連接成小片狀，而ADSCs形成的礦化結(jié)節(jié)較少(圖 3)。半定量分析表明：BMSCs組的鈣鹽沉積量顯著高于ADSCs組，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖 3 細(xì)胞多向分化

2.5 成骨相關(guān)基因表達(dá)對比

COL-1的表達(dá)隨時間變化呈逐漸升高趨勢，成骨晚期ADSCs中COL-1的表達(dá)顯著高于BMSCs。ALP、BMP的表達(dá)隨時間變化呈逐漸降低趨勢，成骨早期BMSCs中ALP、BMP的表達(dá)顯著高于ADSCs。整個過程中OCN、RUNX2、OSX在BMSCs中表達(dá)量顯著高于ADSCs(圖 4)。

圖 4 ADSCs及BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)

2.6 成膜能力對比

2 組細(xì)胞均可形成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，連接成片狀。細(xì)胞之間通過板狀偽足連接。橫截面見ADSCs膜片厚度明顯大于BMSCs(圖 6)，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。HE染色顯示兩種細(xì)胞均形成細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞三明治樣結(jié)構(gòu)，ADSCs膜片擁有更多的細(xì)胞層數(shù)以及更豐富的細(xì)胞外基質(zhì)(圖 6)，說明ADSCs比BMSCs擁有更強(qiáng)的增殖能力和膠原分泌的能力。

圖 5 細(xì)胞膜片掃面電鏡觀及HE染色

3 討 論

近年來，組織工程技術(shù)應(yīng)用干細(xì)胞提升糖尿病患者的成骨能力，已得到多種證據(jù)證實[9]。大部分實驗基于異體干細(xì)胞的獲取，而在臨床上，此種方法受到一定限制，且其面臨的體內(nèi)的免疫原性仍具有爭議性。自體干細(xì)胞因其臨床易得，能促進(jìn)長期移植的生存和移植耐受，而成為更有前景的細(xì)胞[10]。

現(xiàn)有證據(jù)表明，糖尿病患者來源的BMSCs相比正常BMSCs，數(shù)量減少，再生能力減弱，增殖和存活能力降低[11-12]，成骨分化顯著下降[13]，限制了其在再生方向的應(yīng)用。而糖尿病患者來源的ADSCs，獲取數(shù)量并未減少，生長曲線和對照組類似[14]。對于糖尿病患者自體的ADSCs和BMSCs的比較，卻并無較多討論。

通過比較糖尿病大鼠來源的ADSCs和BMSCs的克隆和增殖能力發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞均可形成克隆，但ADSCs形成能力更佳。而細(xì)胞增殖曲線也表明ADSCs具有更好的增殖潛力。

ALP及茜素紅染色顯示，BMSCs具有更為顯著的成骨能力。但ADSCs膠原定量結(jié)果顯著高于BMSCs，其可形成更多更粗壯纖維。同時ADSCs中COL-1的表達(dá)量顯著高于BMSCs。細(xì)胞膜片電鏡及HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs形成膜片的層數(shù)及厚度的均顯著高于BMSCs，ADSCs擁有更強(qiáng)的增殖和膠原分泌的能力。但其他的骨形成相關(guān)基因，在 BMSCs中的表達(dá)顯著高于ADSCs。

ADSCs來源廣泛、取材容易、患者痛苦小[15]。正常的ADSCs同時顯示出類似于BMSCs的遷移，分化，免疫抑制能力[16]。來源于糖尿病的ADSCs相比BMSCs具有更好的增殖潛力，可能是骨髓中的低氧環(huán)境導(dǎo)致BMSCs面臨早期的增殖老化[17]。ADSCs能形成更多的膠原及細(xì)胞外基質(zhì)，但BMSCs具有更佳的成骨能力，考慮可能是其他成骨相關(guān)基因或后期鈣磷沉積的優(yōu)勢作用。雖然BMSCs的特殊性能可提升其應(yīng)用潛力，但在再生領(lǐng)域中，細(xì)胞增殖是促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及組織再生的重要部分，通過體內(nèi)提升增殖能力來激活內(nèi)源性干細(xì)胞也成為治療糖尿病并發(fā)癥的潛在策略[18],且ADSCs更適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)環(huán)境，體外培養(yǎng)可形成更穩(wěn)定的細(xì)胞特性[17]。就此而言，糖尿病患者ADSCs相比BMSCs在自體干細(xì)胞應(yīng)用中具有更好的前景。