一株晚花和鎘敏感擬南芥突變體的分離與鑒定

張林林,金竹萍,張麗萍,張嬌,張曉峰,裴雁曦

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,特色植物資源研究與利用山西省重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

鎘(Cd)是最具毒性的重金屬之一,可以通過食物鏈危害人類健康。近年來,重金屬(尤其是Cd)對擬南芥的毒性作用引起了極大的關(guān)注。Cd對植物造成的危害包括根的生長減慢、光合作用降低、氧化損傷加劇,以及產(chǎn)生遺傳毒性等,甚至致使植物死亡[1]。相應(yīng)地,植物體也采取多種應(yīng)對策略來抵御Cd造成的傷害,如增加Cd向液泡中的轉(zhuǎn)運和區(qū)室化,以及合成植物螯合肽(PC)、金屬硫蛋白(MT)等[2-4]。植物耐受Cd的分子機制包括阻止根系對Cd的吸收、液泡膜內(nèi)向轉(zhuǎn)運減少Cd的毒害以及螯合作用對Cd的解毒[5-7]。利用植物突變體可以更加深入地研究植物對鎘脅迫的響應(yīng)機制。Howden[8]和Cobbett[9]最早獲得了擬南芥Cd敏感突變體cad1和cad2,從而利用Cd敏感突變體鑒定了一些可以催化PC合成的酶,更好地表征了植物螯合素表達對重金屬耐受性的重要作用。但是,除了這些具有開創(chuàng)性的研究,鮮有其他Cd敏感擬南芥突變體的研究報道。

在擬南芥中,開花時間是信號通路復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果[10]。該網(wǎng)絡(luò)包括4個主要的經(jīng)典途徑:春化途徑、光周期途徑、自主途徑和赤霉素途徑。自主途徑和春化途徑的基因通過開花抑制子Floweringlocusc(FLC)調(diào)節(jié)開花,而光周期和GA途徑的基因則通過FloweringlocusT(FT)調(diào)節(jié)開花期[11]。FLC的高表達通常會導(dǎo)致晚開花表型,而FLC可以通過直接結(jié)合的方式抑制花誘導(dǎo)劑FT和Suppressorofoverexpressionofco1(SOCI)基因啟動子CArG-box來調(diào)節(jié)其表達[12]。

HOS1可以同時調(diào)節(jié)冷適應(yīng)和春化作用的關(guān)鍵基因[13]。通過Northern分析確定hos1突變體中FLC的表達發(fā)生了改變[14]。在擬南芥中過表達HOS1基因可降低CBF(c-repeatbindingfactor)基因的表達,即HOS1是CBF的負調(diào)控因子[15]。HOS1敲除突變體hos1開花較早,而且CBFs及其下游基因在hos1突變體中表達也明顯增強。CBFs常與DREB(DREBindingprotein)互作發(fā)揮作用,DREB基因過量表達可使植株對氧化脅迫的耐受性增強[16-17]。CBF/DREB基因可用于提高重要農(nóng)作物對氧化脅迫耐受性。然而,35S CaMV啟動子啟動CBF/DREB的過度表達會使植株生長發(fā)育明顯遲緩[18]。使用脅迫誘導(dǎo)型rd29A啟動子代替組成型35S CaMV啟動子來啟動CBF/DREB過表達,可以最小化過量表達對植物生長的負面影響[19-20]。由此可見HOS1及其下游基因CBF/DREB參與氧化脅迫響應(yīng),而Cd脅迫對植物體的損害主要通過對植物細胞產(chǎn)生氧化損傷所致,因此我們猜想HOS1可能會參與植物體的Cd脅迫響應(yīng)。

本文通過篩選和鑒定,獲得了具有晚開花和Cd敏感表型的fcr(FLC-dependent late-flowering and Cd-sensitive mutant)突變體,并分析了其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

使用了哥倫比亞擬南芥種子(Col-0)和化學(xué)誘導(dǎo)型擬南芥XVE誘導(dǎo)型激活突變體種子(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的左建儒教授提供)。植株的生長條件和其他相關(guān)方法描述詳見參考文獻[21]。

1.2 Cd處理

用體積分數(shù)70%乙醇消毒10 s,之后用含有0.05% (V/V)Tween-20的50 g/L氯酸鈉(Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)消毒10 min,對擬南芥種子表面進行滅菌。蒸餾水洗滌3次后,將種子(每組50粒)播種到在含有質(zhì)量分數(shù)1%蔗糖的10 mL 1/2 Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基上,在長日照條件下于 23℃、60% 相對濕度、16/8 h(光/暗)以及 160 μEmm-2 s-1 光照強度的溫室中培養(yǎng)。為了確定Cd毒性對實驗材料的影響,將種子播種于含0、50、80、90、100和150 μmol/L CdCl2的1/2MS培養(yǎng)基中生長。10 d后,測量根長。每個值代表3次重復(fù)的平均值±SD。通過Duncan檢驗進行單因素方差分析(P<0.05)確定顯著性。

1.3 GA處理

植株移植到土壤中后,長日照條件下每3 d用1 mmol/L GA3或水(對照)噴灑一次直到抽薹[21]。

1.4 T-DNA插入分析

使用熱不對稱交錯聚合酶鏈反應(yīng)(TAIL-PCR)對T-DNA插入位點進行分析。TAIL-PCR中使用的引物如下[22]:

LexA3

5′-ATCATCCC CTCGACGTACTGTAC-3′

LexA4

5′-CTGGTTTTATATACAGCAGTCACG-3′

LexA5

5′-AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3′

LexA6

5′-TTGG AGAGGACACGCTG AAGC-3′

AD1

5′-NTCGA (G/C) T (A/T) T (G/C) G(A/T) GTT-3′

AD2

5′-NGTC GA (G/C) (A/T) GANA (A/T)GAA-3′

AD3

5′-(A/T) GT GNAG (A/T) ANCANAGA-3′

AD4

5′-NGTA (G/C) A (G/C) (A/T) GTNA(A/T) CAA-3′

1.5 總RNA提取和RT-PCR

植株總RNA提取和RT-PCR實驗方法見文獻[21]。以cDNA為模板進行RT-PCR,PCR條件為預(yù)變性94℃ 1 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s和72℃ 2 min,重復(fù)25個循環(huán);72℃ 5 min。At1g35820,At1g35830和At1g35840的引物如下:

At1g35820

5′-TATGAAAGGTAAAG GAGGAC-3′

5′-ACAATCCCTTGCCTTC-3′

At1g35830

5′-CAAACTCCGAGAACTGCCTCA-3′

5′-GGGTCAGTTCGAGCTTAGTGG-3′

At1g35840

5′-CCTCTTCTTCCCGAAACCCTA-3′

5′-GTGCGGTCCTTGTCAGTGTC T-3′

圖1 不同濃度CdCl2對擬南芥Col-0根長的影響

2 結(jié)果

2.1 Cd阻礙擬南芥的生長

為了驗證Cd對擬南芥植株中的毒性,進行Cd劑量效應(yīng)實驗。Col-0種子萌發(fā)后移至含有不同濃度CdCl2的1/2 MS中生長10 d，結(jié)果見圖1。CdCl2處理后植株的生長狀態(tài)明顯比對照差(P<0.05)。

Cd脅迫可延緩根的生長并誘導(dǎo)葉的褪綠病(圖1B),根生長隨培養(yǎng)基中Cd濃度的增加而顯著減緩(圖1A)。在90 μmol/L CdCl2下,植株生長部分受阻,但仍可觀察到生長。因此選擇含90 μmol/L CdCl2作為Cd的處理濃度。

圖2 fcr突變體的表型及其T-DNA插入位點

2.2 突變體篩選及fcr突變體的表型

為了篩選獲得Cd敏感突變體,將化學(xué)誘導(dǎo)型擬南芥突變體種子種于含有90 μmol/L CdCl2的1/2 MS中生長10 d,然后將植物移植到含有土壤:珍珠巖:蛭石(1/1/1,V/V/V)的土培基質(zhì)中以觀察表型。

在90 μmol/L CdCl2下,fcr突變體的生長受到完全抑制。fcr突變體和Col-0植株的根生長差異見圖2A。在長日照條件下,fcr突變體生長16周仍沒有開花(圖2B)。與Col-0相比,fcr突變體明顯晚花(圖2C)。為了進一步探索fcr影響開花的途徑,用GA3處理了fcr,可以看出GA3部分恢復(fù)了fcr的晚花表型(圖2D)，這表明fcr影響開花時間可能與GA途徑相關(guān)。

2.3 T-DNA側(cè)翼序列分析

通過TAIL-PCR擴增T-DNA側(cè)翼序列,并在TAIR數(shù)據(jù)庫中進行BLAST發(fā)現(xiàn),突變體fcr的T-DNA插入在At1g35820和At1g35830之間(圖2E)。通過RT-PCR檢測T-DNA插入片段附近基因At1g35820,At1g35830和At1g35840的表達模式。無論是否經(jīng)過春化,它們的轉(zhuǎn)錄水平表達在Col-0和fcr突變體中沒有明顯差異(圖3A)。

圖3 相關(guān)基因在野生型和fcr突變體中表達量的比較

2.4 開花期fcr的分子特征

為了研究突變體的極端晚花表型,通過RT-PCR比較了Col-0和fcr中開花時間相關(guān)基因的表達模式。在fcr中FLC的表達水平顯著高于Col-0,而且FLC的關(guān)鍵靶基因SOCI的表達也顯著降低(圖3B)。

自主途徑中的基因FRI,FRL1,FRL2,VIP3,VIP4,ART1,PIE和ESD4與FLCmRNA的豐度協(xié)同下調(diào),而FCA,FY,FLD,FVE,FPA,LD,FLK和REF6可以上調(diào)FLCmRNA的表達量。因此,分析了這些基因在Col-0和fcr中的表達。結(jié)果顯示,所有基因均沒有在Col-0和fcr中檢測到轉(zhuǎn)錄水平表達差異(圖3C)。

2.5 fcr響應(yīng)Cd脅迫的分子機制

植物響應(yīng)Cd的信號途徑尚不清楚。為了驗證fcr的Cd敏感表型,對Cd脅迫下fcr突變體相關(guān)分子途徑相關(guān)基因進行了檢測。通過RT-PCR檢測應(yīng)激相關(guān)基因CBF3的表達模式,發(fā)現(xiàn)該突變體CBF3表達量降低并且突變體中Cd耐受性比Col-0差(圖3D)。在fcr中,HOS1(CBF3的關(guān)鍵上游抑制劑)的表達也顯著增加(圖3D)。

3 討論

重金屬可能對動植物產(chǎn)生毒害。然而植物如何識別和抵御重金屬毒性的潛在分子機制尚未全部發(fā)掘[22]。通過對Cd敏感突變體的研究發(fā)現(xiàn),植物可通過多種分子機制來應(yīng)對重金屬脅迫[23]，但很少有Cd敏感的擬南芥突變體報道。本研究通過篩選對Cd響應(yīng)的擬南芥突變體,獲得了一個突變體,表現(xiàn)出Cd敏感表型和晚開花表型。通過分子遺傳分析,發(fā)現(xiàn)fcr是一個新的Cd敏感的T-DNA插入突變體(圖2)。

圖4 fcr突變體中調(diào)節(jié)響應(yīng)Cd脅迫和開花時間的可能機制

FLC的表達量可用于表征春化途徑相關(guān)的晚花突變體。fcr中FLC的表達水平顯著高于Col-0,而SOCI的表達也隨FLC的增加而受抑制(圖3),但已知的FLC上游基因的表達未改變。有趣的是,fcr中應(yīng)激相關(guān)基因CBF3的關(guān)鍵上游抑制基因HOS1的表達水平顯著高于Col-0。TAIL-PCR結(jié)果顯示該突變體中的T-DNA插入在At1g35820和At1g35830之間。T-DNA插入導(dǎo)致的Cd敏感和晚花表型可能與HOS1的表達變化有關(guān)。

在寒冷適應(yīng)中,HOS1對冷脅迫響應(yīng)基因有負調(diào)節(jié)作用。在hos1突變體中,冷誘導(dǎo)下CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子含量增加；即使沒有春化處理,hos1突變植物的FLC表達水平也明顯較低，這種FLC低水平表達與hos1突變體的早花表型相關(guān)[14]。這些結(jié)果表明HOS1是春化作用的負調(diào)節(jié)劑,是FLC高水平表達所必需。

綜上所述,HOS1可能參與在fcr突變體響應(yīng)Cd敏感和晚花途徑，但HOS1如何參與Cd響應(yīng)和開花時間調(diào)控這兩個途徑的潛在分子機制還需要進一步的深入研究來確定。此外,還需要進一步探索fcr的突變位點是如何在分子水平影響開花時間調(diào)節(jié)和Cd脅迫響應(yīng)的。