氣相色譜法測定氟比洛芬酯中雜質1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯的限度

徐家根，浦迎秋*，顧琦欣，傅辰超

1南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院 藥學部，南京 210008;2南京優(yōu)科制藥有限公司，南京210009

氟比洛芬酯[1]作為一種非甾體類抗炎藥，能降低神經(jīng)敏感程度及痛覺沖擊，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。氟比洛芬酯的合成過程中會使用到1-溴乙基乙酸酯作為起始物料，而2-溴乙基乙酸酯是合成的副產(chǎn)物存在于氟比洛芬酯中，這兩種物質屬于烷基鹵化物類化合物，具有鹵代烷烴類結構，是潛在的基因毒性雜質[2]，需要建立有效的方法測定氟比洛芬酯中上述兩種雜質限度，以保證該藥符合質量要求。

由于1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯兩種物質屬于烷基鹵化物類化合物不存在紫外吸收，無法使用常規(guī)的HPLC 法進行檢測。而氣相色譜法是利用氣體作流動相的色層分離分析方法，氣化的試樣被載氣（流動相）帶入色譜柱中，柱中的固定相與試樣中各組分分子作用力不同，各組分從色譜柱中流出時間不同，組分彼此分離。根據(jù)峰的高低和面積大小，可對化合物進行限度或定量分析。適用于易揮發(fā)有機化合物的定性、定量分析。氣相色譜法中的電子俘獲檢測器（ECD）是靈敏度較高的氣相色譜檢測器[3]，其只對電負性的化合物有信號，待測物電負性越強，靈敏度越高，對于中性（無負電性）化合物，如烷烴、環(huán)烷烴，則無信號或信號非常小。相比氣相色譜儀常用的火焰離子化檢測器（FID），測定含有鹵族元素的有機化合物，ECD 優(yōu)勢非常明顯，所以選擇該檢測器（ECD）檢測氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的限度更為準確、靈敏。

1 儀器與藥品、試劑

GC-2014 氣相色譜儀，配制電子捕獲檢測器（ECD）、直接進樣器AOC-20i（島津公司）；BPZ11D型電子天平（Sartorius）。

供試品：氟比洛芬酯（批號：20190501、20190502、20190503，南京優(yōu)科制藥有限公司）；對照品：1-溴乙基乙酸酯（純度：95.0%，加拿大TRC 公司）；2-溴乙基乙酸酯（純度：97.9%，美國Sigma 公司）。正己烷（Merck，HPLC 級）。

2 方法與結果

2.1 限度確認及各溶液濃度設定

根據(jù)ICH M7 指導原則，依照短于生命周期的可接受攝入量原則，詳情見表1。采取最為嚴格的控制條件，設定雜質可接受攝入量為1.5 μg·d-1。根據(jù)氟比洛芬酯注射液說明書可知，其日使用劑量為50mg，由此計算出1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯在供試品中限度值均為0.003%。為保證檢驗的重現(xiàn)性與準確度，選取1-溴乙基乙酸酯定量限2 倍的濃度作為對照品溶液濃度，故確定其為0.06 μg·mL-1，依據(jù)限度為0.003%，確定供試品溶液濃度為2 mg·mL-1。根據(jù)分析天平分度值要求及操作規(guī)定，本檢驗方法設計供試品取樣量為20 mg。

表1 短于生命周期的可接受攝入量

2.2 色譜條件

采用毛細管氣相色譜法。色譜柱：Agilent（DB-1701，60 m×0.53 mm×0.25 μm）；載氣：氮氣；起始溫度為50 ℃，維持3 min。以每分鐘2 ℃的速率升溫至80 ℃，維持5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至100 ℃，再以每分鐘20 ℃的速率升溫至180 ℃，維持3 min；進樣口溫度：150 ℃；檢測器溫度：300 ℃；柱流量：4.0 mL·min-1；進樣量：1 μL。

測定法：精密量取對照品溶液和供試品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。

2.3 溶液制備

對照品貯備溶液：取1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯對照品適量，精密稱定，加正己烷溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯均為6 μg 混合儲備溶液。

對照品溶液：精密量取對照品貯備溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加入正己烷稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：取本品20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。

空白溶劑：正己烷。

2.4 專屬性試驗

取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件測定，通過圖1 可知，空白溶劑及其他雜質均不干擾本品中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的測定，且保留時間分別為10.572 min 及15.218 min，兩峰之間分離度為30.22，兩雜質的理論板數(shù)分別為95388 及126121。該方法專屬性良好，適合本品中兩雜質的限度測定。

2.5 檢測限及定量限

取“2.3”項下對照品貯備溶液適量，分別用正己烷逐級稀釋后，量取1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比10∶1 計算定量限，按信噪比3∶1 計算檢測限。結果1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的定量限及檢測限分別為0.031 880、0.008 444 μg·mL-1；0.006 237、0.003 119 μg·mL-1。

2.6 線性范圍

取“2.3”項下對照品貯備溶液適量，用正己烷稀釋制成每1 mL 中約含1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯均為0.6 μg 的溶液，精密量取上述溶液0.4、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分別置10 mL 量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為兩雜質對照品系列溶液。精密量取系列溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，并計算得兩者的回歸方程分別為Y1=2.14×103X1-6.027 0，r=0.997 1；Y2=2.80×103X+2.077 7，r=0.997 4。結果表明，1-溴乙基乙酸酯濃度在0.024 20 μg·mL-1～0.090 76 μg·mL-1范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系（r=0.997 1）；2-溴乙基乙酸酯濃度在0.009 397 μg·mL-1～0.070 47 μg·mL-1范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系（r=0.997 4），線性關系良好。

2.7 進樣精密度試驗

取“2.3”項下對照品溶液，精密量取1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進樣6 次，計算各溶液峰面積的相對標準偏差。結果表明，1-溴乙基乙酸酯對照品溶液濃度的進樣精密度為6.8%；2-溴乙基乙酸酯對照品溶液濃度的進樣精密度為5.9%；RSD 均小于10%。精密度能滿足測定要求。

2.8 重復性試驗

稱取氟比洛芬酯約20 mg，共6 份，采用擬定的測定方法分析。結果表明，在樣品中，1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯未檢出，方法重復性良好，能滿足本品雜質限度的測定要求。

2.9 耐用性試驗

分別考察了不同柱溫、進樣口溫度、流速對氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯限度測定的影響，見表2。由表2 可知，上述因素在一定范圍內變化對氟比洛芬酯中兩雜質的分離度影響不大，兩雜質峰的分離度均能滿足本品雜質限度測定的要求，且供試品在不同的色譜條件下兩雜質均未檢出。

表2 耐用性試驗結果

2.10 回收率試驗

分別稱取氟比洛芬酯（批號：20190501）20 mg共9 份，精密稱定，分別置于10 mL 量瓶中，根據(jù)“2.8”項下兩雜質未檢出的結果，因此加樣回收率試驗需向供試品中加入對照品儲備液0.8、1.0、1.2 mL，用正己烷溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，作為待測溶液，按照“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算測得量。1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的平均回收率及RSD 分別為976.69%、3.4%；101.3%、4%?；厥章示?0%～120%。說明本方法可以用于氟比洛芬酯原藥雜質限度的測定。

2.11 供試品測定

取3 批供試品（批號：20190501、20190502、20190503）各適量，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的雜質量。結果表明，3 批供試品中兩雜質均未檢出，限度達標。

3 小 結

氟比洛芬酯為氟比洛芬的前體藥物，用于手術后及各種癌癥的鎮(zhèn)痛，其優(yōu)點在于沒有中樞抑制作用，不影響處于麻醉狀態(tài)患者的蘇醒。為保證氟比洛芬酯原藥質量，有必要建立合理且有效的分析方法定量檢測其雜質，使雜質不得超過限度要求。本文采用氣相色譜法測定藥物中烷基鹵化物類基因毒性雜質，檢測具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點。