比較兩種兔頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞方法*

張安東 劉華蔚 李永鋒 徐 娟 胡 敏

周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)一直以來都是醫(yī)學(xué)中的一個(gè)亟需攻克的難題[1]。對(duì)于長(zhǎng)段神經(jīng)缺損的病例來說，無法做到無張力縫合，自體神經(jīng)移植是金標(biāo)準(zhǔn)，但是自體神經(jīng)的來源有限，并且易引起神經(jīng)供區(qū)瘢痕、神經(jīng)瘤的形成和運(yùn)動(dòng)感覺障礙。此外，自體靜脈移植以及殼聚糖導(dǎo)管移植等方法在臨床均有應(yīng)用，但神經(jīng)功能的恢復(fù)不太理想[2，3]。脫細(xì)胞血管基質(zhì)具有獨(dú)特復(fù)雜的三維管狀結(jié)構(gòu)，可為神經(jīng)再生提供一個(gè)良好的通道，且有利于細(xì)胞的黏附與增殖，經(jīng)過脫細(xì)胞處理后后，生物相容性良好[4]，是一種理想的神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管。迄今為止，關(guān)于血管脫細(xì)胞方法已有許多研究，存在一些問題如制備時(shí)間長(zhǎng)，血管在離體后易發(fā)生降解，失去原有的管腔結(jié)構(gòu)；細(xì)胞毒性殘留；力學(xué)結(jié)構(gòu)破壞，機(jī)械性能差等[5]?；瘜W(xué)除垢劑如Triton、SDS 已被證實(shí)會(huì)殘留細(xì)胞毒性及破壞血管支架的力學(xué)結(jié)構(gòu)[6，7]。超高壓作為在組織工程領(lǐng)域內(nèi)的一項(xiàng)較新的技術(shù)，已被少量學(xué)者用于制備脫細(xì)胞血管支架[8-10]。糜蛋白酶與其他酶類相比，脫細(xì)胞效果強(qiáng)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響較小[11]。本研究旨在研究超高壓復(fù)合酶法制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)，并與本課題組前期兔頸動(dòng)脈脫細(xì)胞方法[12]比較，尋求更簡(jiǎn)單、理想的脫細(xì)胞方法。

1. 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供雌性的新西蘭白兔10 只(體重2～2.5kg)，許可證號(hào)SCXK(京)2015- 0005，實(shí)驗(yàn)過程始終遵循動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 試劑與儀器 糜蛋白酶(北京華越洋生物科技)，RNaseA(Sigma，美國(guó))，DNase- I(Sigma，美國(guó))，曲拉通X- 100(tritonX- 100，美國(guó)sigma公司)，Quant- iTTMDNA 檢測(cè)試劑盒(Invitrogen美國(guó))，羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成)4%多聚甲醛溶液(上海太平洋化集團(tuán)試劑廠)，蘇木素復(fù)染劑(邁新福州生物技術(shù)開發(fā)公司)，D- hanks 液(實(shí)驗(yàn)室配制)，PBS 緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制)，Hoechst33258熒光染料(Sigma，美國(guó))，乙二胺四乙酸(EDTA，美國(guó)Sigma 公司)，胰蛋白酶/ 乙二胺四乙酸(2.5%trypsin- EDTA，美國(guó)Gibco 公司)，十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)(美國(guó)sigmaaldrich 公司)，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF，中國(guó)solarbio 公司)，青霉素/ 鏈霉素(美國(guó)hyClone 公司)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)，AxioZoom.V16 型立體顯微鏡(德國(guó)carlZeiss 公司)，BX51 型顯微鏡(日本olympus 公司)，MS260 型電子天平(上海電子天平一廠)，超高壓生物處理器(HPP- 400/ 1 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司)，常規(guī)手術(shù)縫線、器械，顯微器械以及速眠新、氯胺酮等注射藥物均由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 脫細(xì)胞血管的制備方法

1.2.1 兔頸總動(dòng)脈的獲取 在麻醉、無菌條件下，取出兔頸總動(dòng)脈，立即置于含有雙抗的無菌PBS 液中。用無菌PBS 液沖洗血管及管腔直到完全去除血液及雜質(zhì)，用顯微手術(shù)器械去除血管外的結(jié)締組織和脂肪成分，去除血管外膜。截取長(zhǎng)度為3cm、無明顯分支、內(nèi)徑約3mm 的動(dòng)脈30 根作為實(shí)驗(yàn)材料，并將材料分為3 組，即對(duì)照組(新鮮血管)；實(shí)驗(yàn)組：1(化學(xué)法+ 酶法)組，2(超高壓+ 酶)組，每組各10 根血管。

1.2.2 脫細(xì)胞血管基質(zhì)的制備 化學(xué)法+ 酶法組：用蒸餾水處理24h 后，0.125%Trypsin-EDTA 消化4h，PBS 沖洗3 遍。加入1%TritonX-100(加入1μmol/ L PMSF+0.02%EDTA)40ml 作用24h，PBS 沖洗至無泡沫。蒸餾水再處理12h(每隔6h 換液)，隨后加入1%SDS(1μmol/ LPMSF+0.02%EDTA)40ml 作用24h，PBS 沖洗至無泡沫。用DNA 酶/ RNA 酶作用24h，最后蒸餾水處理12h(每隔6h 換液)。整個(gè)過程中均放置于37℃恒溫?fù)u床上持續(xù)作用。冷凍干燥保存。

超高壓+ 酶法組：將血管以無菌PBS 液反復(fù)沖洗洗凈后，和無菌PBS 溶液一起密封入特制塑料袋中。將塑料袋置入超高壓生物處理機(jī)(HPP-400/ 1 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司)中，500MPa，4℃條件下處理5 次，每次在壓力達(dá)到500MPa 時(shí)，保持1 分鐘，隨后泄壓，壓力驟降為0Pa，然后立即升壓至500MPa，如此循環(huán)。處理結(jié)束后無菌條件下將取出血管。將血管置入含1%糜蛋白酶和20ug/ mlRNaseA、200ug/ mlDNaseI 的離心管中，垂直置于37℃恒溫?fù)u床，在37℃的條件下反應(yīng)14h，用pbs 震蕩沖洗2h。

兩組血管脫細(xì)胞處理后和對(duì)照組新鮮血管一起均冷凍干燥保存。

1.3 組織學(xué)觀察

①HE 染色(觀察細(xì)胞殘留)

標(biāo)本固定(4%多聚甲醛)24h →80%- 100%乙醇梯度脫水→二甲苯兩次透明→浸蠟3h(更換3 次石蠟)→石蠟包埋(65℃)→切片(厚度約4μm)。石蠟切片二甲苯脫蠟2 次，每次5min→無水乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min，自來水沖洗3min，蒸餾水洗2min→蘇木素染液10min，自來水沖洗2min→1%鹽酸分化液分化數(shù)秒，提插數(shù)下，自來水沖洗3min→返藍(lán)液返藍(lán)/ 伊紅5min，自來水沖洗3min→80%乙醇脫水1min→90%乙醇脫水2 次，每次2min→無水乙醇脫水2 次，每次2min→二甲苯Ⅰ透明5min→二甲苯Ⅱ透明7min→中性樹膠封固，鏡檢。

②EVG 染色：在計(jì)算機(jī)上運(yùn)用Image- pro Plus 軟件觀察，EVG(×400)染色切片，在圖片上打整齊均勻排列的十行十列一百個(gè)點(diǎn)，然后分析一百個(gè)測(cè)試點(diǎn)，其中測(cè)試點(diǎn)黑色表示彈性纖維，粉紅色點(diǎn)表示膠原纖維。進(jìn)行分析后，計(jì)算每種組分的相對(duì)體積分?jǐn)?shù)。

1.4 DNA 和羥脯氨酸含量的測(cè)定

1.4.1 DNA 含量測(cè)定 利用Quant- iTTMDNA檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定對(duì)照組新鮮血管和實(shí)驗(yàn)組各組脫細(xì)胞血管材料殘留DNA 含量的變化。

1.4.2 羥脯氨酸含量的測(cè)定 利用羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒及多功能光度計(jì)分別測(cè)定對(duì)照組新鮮血管和實(shí)驗(yàn)組各組脫細(xì)胞血管材料羥脯氨酸含量的變化。

1.5 最終抗張強(qiáng)度 將脫細(xì)胞血管基質(zhì)修剪成寬度約5mm 的環(huán)狀，縱向剪開后得到以血管周徑為縱軸的條狀材料。將條狀材料的兩端用生物拉力機(jī)的樣品夾固定，滑塊牽動(dòng)樣品夾反向運(yùn)動(dòng),直至材料斷裂，重復(fù)測(cè)量各處理組材料樣品并記錄每次材料斷裂時(shí)的張力，用tremax 軟件在計(jì)算機(jī)上生成拉力圖形。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS17.0 單因素方差分析比較，組與組之間比較采用q 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 HE 染色結(jié)果顯示：從染色結(jié)果來看2 組處理均能將細(xì)胞去除干凈，并且纖維成分保留完整，未見明顯區(qū)別，僅保留了細(xì)胞外基質(zhì),主要成分是膠原和彈性纖維，纖維連續(xù)沒有發(fā)生斷裂，排列整齊，無明顯的水腫。

圖1 HE 染色低、高倍鏡觀察(×100)(×200)

圖2 EVG 染色低、高倍鏡觀察(×100)(×200)

EVG 染色：觀察膠原纖維(見表1)和彈性纖維(見表2)的含量情況。

表1 脫細(xì)胞血管的膠原纖維含量(%)(x±s)

表2 脫細(xì)胞血管的彈性纖維含量(%)(x±s)

2.2 DNA 及羥脯氨酸含量

化學(xué)+ 酶法與超高壓+ 酶法組的DNA 含量與新鮮血管相比明顯減少，且均低于1.0ug/ g，說明兩種脫細(xì)胞方法制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)的細(xì)胞成分已經(jīng)去除。對(duì)照組(新鮮血管)和化學(xué)+ 酶法與超高壓+ 酶法組的羥脯氨酸含量無明顯差異(P＜0.05)。

表3 DNA 及羥脯氨酸含量的測(cè)定

2.3 力學(xué)性能測(cè)試 實(shí)驗(yàn)組脫細(xì)胞血管的最終抗張強(qiáng)度測(cè)試見過見表4。

表4 最終抗張強(qiáng)度及曲線

A：化學(xué)法+ 酶組

B：超高壓+ 酶組

C：新鮮血管

3. 討論

當(dāng)今，由于車禍、戰(zhàn)爭(zhēng)、手術(shù)等原因，周圍神經(jīng)缺損的患者數(shù)量快速增長(zhǎng)，其中長(zhǎng)段神經(jīng)缺損的患者約占35%，由于此類患者無法進(jìn)行直接的無張力縫合，而作為金標(biāo)準(zhǔn)的自體神經(jīng)移植又有諸多限制，因此臨床上亟需可用于修復(fù)大段神經(jīng)缺損的材料。周圍神經(jīng)的修復(fù)主要集中在如何讓再生的神經(jīng)長(zhǎng)得“快”與長(zhǎng)得“準(zhǔn)”上，神經(jīng)導(dǎo)管不應(yīng)只是簡(jiǎn)單的為神經(jīng)修復(fù)再生提供一個(gè)暢通無阻的通道，還需有如物質(zhì)交換功能、細(xì)胞因子梯度緩釋、利于細(xì)胞粘附等的功能[13]。脫細(xì)胞血管支架，其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和良好的細(xì)胞親和力使得其在作為神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，所以維持脫細(xì)胞血管支架的三維結(jié)構(gòu)和生物相容性是制備支架過程中的重點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外常用的脫細(xì)胞方法包括:機(jī)械法，酶消化法，化學(xué)去垢劑法等。以上幾種方法各有利弊，物理的方法對(duì)支架結(jié)構(gòu)的破壞較小但脫細(xì)胞效果較差，而化學(xué)去垢劑方法脫細(xì)胞效果較好卻容易破壞血管的膠原結(jié)構(gòu)[14]。另外，在利用TritonX-100 或SDS 等制備生物材料時(shí)，去垢劑的殘留會(huì)導(dǎo)致脫細(xì)胞生物材料具有一定程度的細(xì)胞毒性。需要較長(zhǎng)時(shí)間的浸泡和漂洗，增加了制作過程中的污染機(jī)會(huì)。陸軍[15]等在實(shí)驗(yàn)中明確了胰蛋白酶可以嚴(yán)重破壞血管支架的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)小。Wang F[10]通過比較發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶的脫細(xì)胞效果要優(yōu)于胰蛋白酶，且對(duì)脫細(xì)胞血管基質(zhì)結(jié)構(gòu)無明顯破壞。核酸酶由于其對(duì)DNA/ RNA 的特異性，不會(huì)對(duì)血管的蛋白結(jié)構(gòu)造成影響。

超高壓生物處理技術(shù)早期應(yīng)用在食品及制藥領(lǐng)域，用于對(duì)食品和藥品的滅菌。國(guó)內(nèi)外已有少量學(xué)者將超高壓技術(shù)用于制備脫細(xì)胞血管基質(zhì)，并已經(jīng)證明了超高壓對(duì)細(xì)胞裂解的促進(jìn)作用，同時(shí)組織學(xué)檢測(cè)和力學(xué)性能測(cè)試表明，超高壓對(duì)脫細(xì)胞血管基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性能影響較小[8，9]，但是關(guān)于制備脫細(xì)胞血管支架的最佳參數(shù)，尚未有明確的定論。

本實(shí)驗(yàn)中，本課題組首創(chuàng)了“升壓- 降壓”循環(huán)，短時(shí)間、多次數(shù)的超高壓生物處理方法，利用超高壓在脫細(xì)胞血管支架上釋放和消失時(shí)的“膨脹- 收縮”原理，使細(xì)胞在此過程中更充分的裂解，通過瞬間將一定數(shù)值的超高壓施放在支架上，作用1 分鐘后，瞬間降壓，直至為零，如此反復(fù)。并聯(lián)合使用了超高壓+1%糜蛋白酶+ 核酸酶的方法制備脫細(xì)胞血管支架，并與課題組前期的0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶脫細(xì)胞方法比較。DNA 及羥脯氨酸含量的測(cè)定的結(jié)果顯示，兩種方法均能完全去除血管的細(xì)胞成分，并且對(duì)血管膠原纖維沒有明顯破壞。從時(shí)間上來看，化學(xué)法+酶法(對(duì)照組)約用時(shí)124h，超高壓+ 酶法(實(shí)驗(yàn)組)僅用時(shí)約17h。HE 染色結(jié)果顯示：化學(xué)法+ 酶法組血管中膠原纖維形態(tài)不規(guī)則，呈波浪形，纖維間出現(xiàn)空隙，而超高壓+ 酶法組血管膠原纖維連續(xù)無斷裂，排列致密，形態(tài)規(guī)則，說明了0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶的方法會(huì)對(duì)血管支架力學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。EVG 染色測(cè)定了2 組脫細(xì)胞血管的膠原纖維及彈性纖維的量，且含量均為超高壓+ 酶法＞化學(xué)法+ 酶法,P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)在最終抗張強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)中，超高壓+ 酶法組的血管支架表現(xiàn)出了更優(yōu)良的拉伸性能。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證明了超高壓復(fù)合1%糜蛋白酶及核酸酶的方法，脫細(xì)胞效果良好，與前期的0.125%胰蛋白酶+1%Triton+%SDS+ 核酸酶的方法相比，對(duì)血管支架的纖維的量與質(zhì)的影響較小，且用時(shí)較短，是一種更簡(jiǎn)潔、實(shí)用的制備脫細(xì)胞血管支架的方法。