高糖環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)性的研究*

關(guān)淼升 王瀟宇 劉 琳 傅 博 王田田 沈婉君 李鴻波

糖尿病是一種由多種病因引起的代謝紊亂，其特征是由于胰島素分泌缺陷或者胰島素功能異常所引起的慢性的高血糖和糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1]。先前研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于維持骨形成和再吸收之間的平衡具有重要意義[2]。糖尿病會(huì)抑制成骨愈合過(guò)程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、增殖和分化成成骨細(xì)胞的能力。高血糖環(huán)境下rBMSCs 的增殖、成骨分化、ALP 活性、膠原分泌功能受到抑制；RUNX2、BMP- 2、骨鈣蛋白、骨橋蛋白基因表達(dá)下降；BMP 信號(hào)通路、PI3K/AKT 通路抑制[3,4]。高糖環(huán)境下rBMSCs 功能減弱，是糖尿病患者骨質(zhì)疏松、牙槽骨喪失、種植修復(fù)成功率低的重要原因,但是其機(jī)制仍不清楚。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)[5,6]，線(xiàn)粒體自噬現(xiàn)象和rBMSCs 的成骨分化相關(guān)。線(xiàn)粒體自噬，即線(xiàn)粒體的自噬，一種特殊形式的自噬，通過(guò)這種自噬將受損或衰老的線(xiàn)粒體或線(xiàn)粒體的一部分向溶酶體遞送以進(jìn)行降解的現(xiàn)象，是一種線(xiàn)粒體的質(zhì)量控制形式[7]。線(xiàn)粒體自噬被認(rèn)為是一種細(xì)胞存活機(jī)制，負(fù)責(zé)清除受損，多余或老化的線(xiàn)粒體[8]。盡管如此，還沒(méi)有線(xiàn)粒體自噬在高糖環(huán)境中的對(duì)rBMSCs 成骨分化作用的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究的目的在于探討rBMSCs 在高糖環(huán)境下線(xiàn)粒體自噬和成骨分化的相關(guān)性。

1. 材料和方法

1.1 材料 SD 大鼠(2 周齡，25～35g，SPF 級(jí))；rBMSCs 完全培養(yǎng)基(L- DMEM(Corning)+10%FBS(Corning)+1%青鏈霉素(Sigma)+1%谷氨酰胺(Sigma)；rBMSCs 分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)(L- DMEM 培養(yǎng)基中含有10%FBS、L- 抗壞血酸50mg/ L(Sigma)、β- 甘油磷酸鈉10mmol/ L(Sigma)、地塞米松10-7mol/ L(Sigma)，1%青鏈霉素)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM 培養(yǎng)基10%FBS，1μM 地塞米松，0.5mM IBMX(Sigma)，10μg/ μl 胰島素(Invitrogen)和100μM 吲 哚 美 辛(Sigma)；抗LC3 抗 體(Abcam)，抗ALP 抗體(Abcam)，OPN(Abcam)。

1.2 SD 大鼠rBMSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定 取2 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)細(xì)胞[9]。具體方法為：SPF 級(jí)SD 大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5～10min，把股骨、脛骨、肱骨解剖分離出來(lái)、放入盛有預(yù)冷的PBS 的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿放在冰袋上保持低溫)，用直鑷、彎鑷、眼科剪配合剝離掉骨頭上面附著的肌肉筋膜(不要蠻力弄斷骨骺端)。用剪刀剪斷骨骺端使骨髓腔暴露出來(lái)，用1mL 注射器吸取BMSC 完全培養(yǎng)基，把針頭插進(jìn)髓腔把骨髓沖出來(lái)紅色的絮狀物，沖進(jìn)另一個(gè)新的盛有BMSC 完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。沖至顏色發(fā)白是即髓腔被沖干凈。把沖出的骨髓懸液收集到離心管中，輕輕吹打均勻，到紅色絮狀看不見(jiàn)。吹打后的懸液用濾網(wǎng)過(guò)濾去除混入的細(xì)微的肌肉、筋膜組織，將過(guò)濾后的液體接種在T75 的塑料培養(yǎng)瓶中，一只大鼠的所有細(xì)胞可以接1～2 個(gè)培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)皿大概需要15mL 的培養(yǎng)基。首次分離細(xì)胞做計(jì)為day0。每隔兩天換液，換的時(shí)候就把所有培養(yǎng)基吸掉，加新的培養(yǎng)液就行，大概2～3d就能看到瓶底一團(tuán)一團(tuán)的小集落，細(xì)胞是小短梭形的，之后集落就越來(lái)越大，集落之間有時(shí)候還會(huì)有接觸。大概7day 細(xì)胞可以長(zhǎng)至80%～90%融合度，此時(shí)可以傳代。每?jī)商煊猛耆囵B(yǎng)基換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)傳代，待細(xì)胞傳至P3 代時(shí)，光學(xué)顯微鏡下拍照。流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行CD29+、CD73+、CD90+和CD105+、CD34+和CD31+標(biāo)記物表征。取P3 代rBMSCs 分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 天后1%茜素紅染色和成脂誘導(dǎo)14 天后油紅O 染色，并在光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.3 rBMSCs 在高糖環(huán)境下細(xì)胞增殖及成骨分化實(shí)驗(yàn) 將P3 代rBMSCs 以1000 個(gè)/ 孔的密度接種在96 孔板，待細(xì)胞貼壁后更換不同葡萄糖濃度的完全培養(yǎng)基(5.5mM，15mM，30mM，40mM)培養(yǎng)7 天，每種濃度設(shè)3 個(gè)副孔，分別在第1 天、第3 天、第5 天和第7 天，應(yīng)用Celigo 全視野細(xì)胞掃描分析儀觀察細(xì)胞融合情況，根據(jù)細(xì)胞融合度繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。將P3 代細(xì)胞以5×104/ mL 的密度接種在12 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后換用5.5mM葡萄糖濃度、30mM 葡萄濃度和30mM 甘露醇濃度的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2 天換液，誘導(dǎo)14 天后1%茜素紅染色，數(shù)碼相機(jī)拍照，Image J軟件分析礦化染色產(chǎn)物百分比。

BGM是美國(guó)NCEP(the National Centers for Environmental Prediction)集合預(yù)報(bào)系統(tǒng)采用的一種初值擾動(dòng)方法。傳統(tǒng)方法主要包含以下幾個(gè)步驟(Toth and Kalnay,1997):

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SNK 檢驗(yàn)用于多個(gè)組均數(shù)的兩兩比較，若P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

(5) 從耗能能力上來(lái)看，角鋼鋼肢厚度對(duì)耗能影響并不大，梁腹開(kāi)孔控制距離后對(duì)耗散影響也不大，而經(jīng)過(guò)較大轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)的節(jié)點(diǎn)替換角鋼會(huì)明顯降低節(jié)點(diǎn)能力耗散系數(shù)。當(dāng)破壞發(fā)生在梁端時(shí)，節(jié)點(diǎn)耗能能力主要取決于梁的抗彎能力及翼緣抗拉抗壓能力。

2.1 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 本研究中分離提取的SD 大鼠rBMSCs 貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣，漩渦樣、集落樣生長(zhǎng)。光鏡下的細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，細(xì)胞輪廓及細(xì)胞核清晰，表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(圖2)，細(xì)胞的分子表型中CD29+(89.8%)、CD73+(86.1%)、CD90+(86.6%)和CD105+(80.2%)表達(dá)成陽(yáng)性，CD34+(8.86%)和CD31+(6.71%)表達(dá)成陰性。成骨誘導(dǎo)14 天，茜素紅染色光鏡下可見(jiàn)大量紅色礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)14 天油紅O 染色，光鏡下可見(jiàn)大量脂滴形成(圖3)。本組分離的細(xì)胞符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)[10]關(guān)于rBMSCs 表面標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)且具有成骨及成脂分化的潛能，表明分離的rBMSCs 具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。

1.4 rBMSCs 成骨分化和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)性的研究

1.4.3 RT- PCR 檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá) 按照2.4.1 分組的方法，將rBMSCs 以5×104個(gè)/ mL 的密度接種在6 孔板內(nèi)，成骨誘導(dǎo)7 天應(yīng)用RT- PCR 檢測(cè)成骨相關(guān)基因和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況?；虬↙C3I、LC3II、ALP 和OPN。18s 作管家基因。通過(guò)NCBI在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)系統(tǒng)設(shè)計(jì)目的基因引物(表1)。使用PrimeScript RT 試劑盒分離，純化和逆轉(zhuǎn)錄各組rBMSCs 的總RNA。在CFX96 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))中一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用2- ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果，并顯示為相對(duì)于對(duì)照(5.5mM 組)的倍數(shù)調(diào)節(jié)。

表1 引物序列設(shè)計(jì)

1.4.4 激光共聚焦顯微鏡觀察Mitotraker 和LC3 共定位情況 將P3 代rBMSCs 以1.5×104/ mL的密度接種在放置有圓形玻璃蓋玻片的24 孔板上，24h 后細(xì)胞爬片，更換成不同葡萄糖濃度骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(分別為5.5mM 低糖組、30mM 高糖組和甘露醇等滲對(duì)照組)，培養(yǎng)7d，待細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)，在含有500 nM MitoTracker R○Deep Red FM的培養(yǎng)基中，37℃下孵育30 min，在- 20℃下將細(xì)胞放入冰冷的100%甲醇中固定15 min，隨后用PBS漂洗3 次，持續(xù)5min，然后用0.3%Triton X- 100透化10min。然后，用PBS 中的2.5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉30min。隨后，將細(xì)胞與針對(duì)LC3B 的一抗在室溫下孵育2h。洗滌后，將它們?cè)谑覝叵屡cCy3- 綴合的抗兔二抗(碧云天)一起溫育1h，洗滌，固定在載玻片上并用共聚焦顯微鏡檢查。Image J軟件分析mito- tracker 和LC3 共定位情況，通過(guò)Image J 軟件分析用皮爾森相關(guān)系數(shù)——Pearson’s correlation coefficient(PCC)進(jìn)行定量。

全新BMW 8系敞篷轎跑車(chē)首次將BMW品牌的純粹運(yùn)動(dòng)血統(tǒng)引入豪華敞篷四座車(chē)型。BMW的全新設(shè)計(jì)語(yǔ)言—現(xiàn)代、精準(zhǔn)、犀利，賦予新車(chē)風(fēng)格獨(dú)特又極富情感張力的外觀。全新開(kāi)發(fā)的軟車(chē)頂在關(guān)閉時(shí)呈現(xiàn)雙門(mén)跑車(chē)低重心的運(yùn)動(dòng)線(xiàn)條，打開(kāi)時(shí)則展現(xiàn)優(yōu)雅的流線(xiàn)造型，時(shí)速50公里下仍可在15秒內(nèi)開(kāi)啟或關(guān)閉。專(zhuān)為BMW 8系開(kāi)發(fā)的動(dòng)力系統(tǒng)和底盤(pán)技術(shù)以及高剛性車(chē)身結(jié)構(gòu)，賦予全新BMW 8系敞篷轎跑車(chē)更強(qiáng)大的運(yùn)動(dòng)能力。先進(jìn)的控制和顯示系統(tǒng)、駕駛輔助系統(tǒng)和互聯(lián)設(shè)備，彰顯舒適性和創(chuàng)新性，提供更加現(xiàn)代的豪華敞篷駕駛體驗(yàn)。

1.4.1 分組 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成骨誘導(dǎo)7 天，按照成骨培養(yǎng)基中糖濃度的不同分別分為5.5mM葡萄糖濃度組、30mM 葡萄濃度組和30mM 甘露醇組。

2. 結(jié)果

1.4.2 Western Blot 檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) Western Blot 檢測(cè)線(xiàn)粒體自噬蛋白LC3 和成骨相關(guān)蛋白ALP、OPN 的表達(dá)情況。按照2.4.1 分組的方法，將rBMSCs 以5×104個(gè)/ mL 的密度接種在6 孔板內(nèi)，成骨誘導(dǎo)7 天后培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)裂解后提取蛋白質(zhì)，上樣到聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用2%的10×CHSEIN 封閉，并與抗LC3、抗ALP 和抗OPN 孵育。使用辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗和Bio- Rad 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)信號(hào)。將蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)于β- actin 標(biāo)準(zhǔn)化。Image J 軟件對(duì)蛋白印記條帶進(jìn)行熒光密度半定量分析。

圖1 倒置顯微鏡下觀察P3 代細(xì)胞形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞鑒定細(xì)胞表面分子標(biāo)志物

圖3 rBMSCs 成骨、成脂分化潛能

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行主成分因子分析，其特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。由表6可知，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，得到前2個(gè)主成分因子的特征值分別為8.237、1.935，方差貢獻(xiàn)率分別為75.206%、17.591%，累積方差貢獻(xiàn)率為92.797%＞85%。故采用前2個(gè)主成分因子為指標(biāo)對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表7。由表7可知，主成分因子1可反映成分1、2、3、5、6、8、9、10、11的信息，主成分因子2可反映成分4、6、7的信息。

2.2 高糖環(huán)境下rBMSCs 增殖情況 應(yīng)用Celigo 全視野細(xì)胞掃描分析儀對(duì)細(xì)胞的增殖分化能力進(jìn)行評(píng)估，其采用高分辨率全孔成像技術(shù)能夠定量分析全孔細(xì)胞的融合度。本研究發(fā)現(xiàn)：5.5mM葡萄糖濃度組下細(xì)胞呈正常的增殖趨勢(shì)；20mM 組細(xì)胞的增殖低糖組相比呈現(xiàn)出一定的影響(圖4)，但是差異程度不顯著(P＞0.05)(圖5)；30mM 組細(xì)胞融合度融合度在第1 天開(kāi)始就顯著低于低糖組(P＜0.001)，且這種抑制顯示出“逐步”或“濃度-時(shí)間相關(guān)”效應(yīng)。40mM 組細(xì)胞增殖的和低糖組相比，細(xì)胞融合度的差異現(xiàn)象更為顯著。

圖4 成全視野細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞融合度

圖5 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

2.3 高糖環(huán)境對(duì)rBMSCs 的成骨分化的影響從茜素紅染色大體照可以定性觀察到，5.5mM 濃度葡萄糖組的茜素紅染色結(jié)節(jié)明顯多于30mM 濃度葡萄糖組，和30mM 甘露醇對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。Image J 軟件對(duì)礦化結(jié)節(jié)面積百分比進(jìn)行半定量分析顯示，5.5mM 濃度葡萄糖成骨誘導(dǎo)組顯著多于30mM 濃度葡萄糖成骨誘導(dǎo)組(P＜0.01)。(圖6)

2.4 成骨相關(guān)蛋白和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 30mM 組的ALP 表達(dá)顯著低于5.5mM 葡萄糖組(P＜0.01), OPN 的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)。LC3 II 和LC3 I 為線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白，可以發(fā)現(xiàn)LC3 II/ LC3 I 表達(dá)情況在5.5mM 組和30mM 高糖組直接存在顯著差異(P＜0.01)，同時(shí)LC3 II 的表達(dá)情況在兩組間也存在差異(P＜0.05)。(圖7)

圖6 高糖環(huán)境對(duì)rBMSCs的成骨分化的影響

圖7 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Day7 時(shí)成骨相關(guān)蛋白和線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

船舶總長(zhǎng)主要取決于航道曲率半徑的限制，目前尚無(wú)理論計(jì)算公式，通常依據(jù)經(jīng)驗(yàn)或?qū)嵈囼?yàn)來(lái)確定。根據(jù)《內(nèi)河通航標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，航道曲率半徑R≥4L(L為船舶總長(zhǎng))[7]，計(jì)算得到京杭運(yùn)河船舶的最大船長(zhǎng)允許值見(jiàn)表3。

2.5 RT- PCR 檢測(cè)高糖環(huán)境下成骨相關(guān)基因和線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因表達(dá) RT- PCR 結(jié)果(圖8)顯示，30mM 組的LC3 II 表達(dá)較5.5mM 組和甘露醇組略有降低，并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而LC3 II與LC3 I 的相對(duì)比值在30mM 高糖組有明顯下降(P＜0.05)。與此同時(shí)，ALP 和OPN 在30mM 組的表達(dá)水平均發(fā)生較為明顯的降低(P＜0.001)。

圖8 RT- PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Day7 時(shí)成骨相關(guān)基因和線(xiàn)粒體相關(guān)基因

2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察Mitotraker 和LC3共定位情況 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，線(xiàn)粒體標(biāo)記物Mitotracker 顯示紅色熒光，LC3 自噬溶酶體標(biāo)記物顯示綠色熒光。兩種熒光的共定位情況結(jié)果可見(jiàn)，5.5mM 濃度葡萄糖的成骨培養(yǎng)基中PCC=0.52；30mM 濃度葡萄糖的成骨培養(yǎng)基中PCC=0.26；30mM 濃度的甘露醇成骨培養(yǎng)基PCC=0.46。(圖9)

3. 討論

圖9 激光共聚焦顯微鏡觀察Mitotraker 和LC3 共定位情況(400×)

rBMSCs 作為最早分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞，被廣泛的用于科學(xué)研究，其具有典型的多潛能分化特性[11]。在本研究中，應(yīng)用Celigo 全視野細(xì)胞掃描分析儀對(duì)細(xì)胞的增殖分化能力進(jìn)行評(píng)估，其采用高分辨率全孔成像技術(shù)能夠定量分析全孔細(xì)胞，避免細(xì)分布不均帶來(lái)的誤差，可以連續(xù)觀察孔內(nèi)細(xì)胞的增殖情況?；诩?xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，本研究采用細(xì)胞的融合度來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖情況，并根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的融合程度繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。通過(guò)增殖曲線(xiàn)圖可以觀察到，在低濃度(5.5mM、15mM)葡萄糖MSC 培養(yǎng)基中，細(xì)胞的增殖未受影響，成正常的S 型增殖曲線(xiàn)；而在高濃度(30mM、40mM)時(shí)細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。Zhang 等的研究結(jié)果[12]也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境能夠抑制牙周膜干細(xì)胞的增殖，其抑制濃度在25mM 以上，與本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類(lèi)似?？紤]到大量研究細(xì)胞高糖環(huán)境的文獻(xiàn)采用30mM 這一濃度[13-15]，并結(jié)合細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究在后續(xù)成骨誘導(dǎo)中的高糖環(huán)境采用30mM 的葡萄糖濃度。

為了探究高糖環(huán)境對(duì)rBMSCs 的成骨分化影響，研究中通過(guò)茜素紅染色進(jìn)行定性及半定量評(píng)估。分別將5.5mM 作為低糖對(duì)照組、30mM 葡萄糖作為高糖組以及30mM 的甘露醇作為等滲對(duì)照組，在不同的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)14 天。茜素紅S 染色是在成骨分化過(guò)程中鑒定鈣沉積物的常用技術(shù)。鈣在螯合過(guò)程中形成茜素紅S- 鈣絡(luò)合物。通過(guò)比較染色面積所占百分比，可以發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下rBMSCs 的成骨分化和低糖對(duì)照組相比受到顯著抑制(P＜0.01)，而甘露醇等滲干預(yù)并未對(duì)成骨分化造成顯著影響。

全域旅游發(fā)展的新觀察和新思考 主持人：厲新建 全域旅游發(fā)展的若干思考 王昆欣 / 大力發(fā)展全域旅游，滿(mǎn)足人民對(duì)美好旅居生活的需求 李柏文 / 如何看待和發(fā)展“全域旅游” 宋 瑞 / 全域旅游戰(zhàn)略的需求側(cè)視角 厲新建 賈 然 傅林峰 01（72）

哺乳動(dòng)物微管相關(guān)蛋白- 1 輕鏈3(microtubule- associated protein- 1 light chain3，LC3)是自噬體的伸長(zhǎng)- 閉合機(jī)制的一部分。其以?xún)煞N形式存在，其中一種形式不和脂類(lèi)結(jié)合，廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)中，稱(chēng)為L(zhǎng)C3I；脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺結(jié)合的形式，并與成熟自噬體的兩個(gè)膜結(jié)合，稱(chēng)為L(zhǎng)C3II[16]。在自噬體形成過(guò)程中，同型LC3- I 轉(zhuǎn)化為的LC3-II，因此可以作為自噬體數(shù)量和自噬的誘導(dǎo)的標(biāo)志物[17]。在研究中評(píng)估了自噬相關(guān)蛋白LC3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境中LC3II 以及LC3II/ LC3I 的表達(dá)程度降低。同時(shí)，成骨相關(guān)蛋白ALP、OPN 的表達(dá)也呈現(xiàn)這一趨勢(shì)。線(xiàn)粒體自噬作為一種線(xiàn)粒體的質(zhì)量控制形式特殊形式，被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞存活機(jī)制，負(fù)責(zé)清除受損，多余或老化的線(xiàn)粒體。Nuschke 等人[18]的研究發(fā)現(xiàn)II 型輕鏈3(LC3- II)蛋白(活性自噬體的標(biāo)記物)的積累與成骨分化相關(guān)，表明在刺激分化時(shí)自噬的激活處于激活狀態(tài)。Nollet 等研究[19]發(fā)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞特異性、自噬缺陷小鼠中敲除用自噬必需基因后發(fā)現(xiàn)自噬和成骨細(xì)胞的礦化和骨穩(wěn)態(tài)相關(guān)。Pei 等的研究[20]也發(fā)現(xiàn)，在成骨譜系定型的間充質(zhì)干細(xì)胞中線(xiàn)粒體內(nèi)無(wú)定形磷酸鈣積累引發(fā)的線(xiàn)粒體自噬通過(guò)BMP/ Smad 信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與生物礦化過(guò)程。類(lèi)似地，本研究的結(jié)果可能提示自噬和rBMSCs 的成骨分化成正相關(guān)，高糖環(huán)境能夠抑制自噬和成骨分化。

為了更進(jìn)一步地評(píng)估高糖環(huán)境對(duì)線(xiàn)粒體自噬的影響，本研究通過(guò)免疫熒光共定位來(lái)評(píng)估線(xiàn)粒體的自噬能力。線(xiàn)粒體自噬的顯著特征是線(xiàn)粒體被雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡或自噬體包裹。因?yàn)樽允审w最終需要與溶酶體融合，所以線(xiàn)粒體自噬可以通過(guò)線(xiàn)粒體與溶酶體標(biāo)記物的共定位進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)分析共定位信號(hào)作為線(xiàn)粒體自噬的指示，可以量化含有線(xiàn)粒體的自噬體與溶酶體結(jié)構(gòu)的成功融合。當(dāng)通過(guò)多通道熒光顯微鏡觀察相同的樣本區(qū)域時(shí)，不同的熒光通道會(huì)激發(fā)出各自標(biāo)記的抗原產(chǎn)生不同顏色的像素信號(hào)，而共定位就可以解釋為在相同像素位置處信號(hào)的存在的現(xiàn)象[21]。因此為了盡可能的減少背景對(duì)于圖像質(zhì)量的干擾，研究中選擇通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行觀察。在定位分析中選擇觀察線(xiàn)粒體標(biāo)記物Mito- tracker 和Cy3 綴合的自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3 的熒光信號(hào)表達(dá)，并通過(guò)皮爾森相關(guān)系數(shù)進(jìn)行定量分析。結(jié)果可見(jiàn)5.5mM 濃度葡萄糖組的共定位情況(PCC=0.52)優(yōu)于30mM 濃度葡萄糖組的共定位情況(PCC=0.26)，而30mM 甘露醇等滲對(duì)照組(PCC=0.46)和5.5mM 組差異不大。上述結(jié)果表明，高糖環(huán)境可能會(huì)抑制rBMSCs 在成骨過(guò)程中的線(xiàn)粒體自噬現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了之前Western Blot 和RT- PCR 結(jié)果。