阿舒瑞韋聯(lián)合達(dá)拉他韋治療慢性丙型肝炎患者初步療效及其病毒準(zhǔn)種變化和耐藥變異特征分析*

卓 麗，許 敏，鄧浩輝

阿舒瑞韋(ASV)聯(lián)合達(dá)拉他韋(DCV)治療慢性丙型肝炎(CHC)方案于2017年在中國(guó)獲得批準(zhǔn)上市，主要適用于丙型肝炎病毒(HCV) 1b基因型感染的CHC和代償期丙型肝炎肝硬化患者，在上市前的臨床試驗(yàn)和目前的臨床應(yīng)用報(bào)道顯示出良好的安全性和臨床療效[1,2]。目前，包括ASV聯(lián)合DCV在內(nèi)的直接抗病毒藥物(DAAs)治療方案仍未達(dá)到100%持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，部分患者經(jīng)DAAs治療后仍有病情復(fù)發(fā)現(xiàn)象[1,3]。本研究應(yīng)用ASV聯(lián)合DCV治療CHC患者，觀察了臨床療效情況，并對(duì)其中1例停藥后病情復(fù)發(fā)患者基線和復(fù)發(fā)時(shí)HCV準(zhǔn)種特征進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年10月～2019年6月廣州市第八人民醫(yī)院門診就診的HCV 1b基因型感染的CHC患者40例，其中CHC和代償期丙型肝炎肝硬化患者分別為27例和13例，α-干擾素經(jīng)治或初治患者分別為15例和25例。納入的患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)廣州市第八人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

(3)變異操作 采用單點(diǎn)變異策略對(duì)機(jī)器選擇鏈進(jìn)行變異操作，隨機(jī)選擇一道工序，改變?cè)摴ば虻漠?dāng)前加工機(jī)器。采用互換變異策略對(duì)工序順序鏈進(jìn)行變異操作，如圖7所示，隨機(jī)選擇不同位置兩道工序，互換其基因值。

1.2 治療方法 給予所有患者ASV(百時(shí)施貴寶)100 mg口服，2次/d，DCV(百時(shí)施貴寶)60 mg口服，1次/d，治療24 w。在治療結(jié)束后繼續(xù)隨訪12 w。

1.3 血清HCV耐藥變異和準(zhǔn)種分析 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，德國(guó))病毒核酸提取試劑盒提取血RNA，使用HCV 1b基因型特異引物(5′-CTACCCCTACRGAAAGTAGGAGTAGGCA-3′，nt9324-nt9351，HCV H77，NC_004102)和PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行HCV RNA逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)HCV 1b基因型保守區(qū)設(shè)計(jì)引物(表1)，并在引物5’端隨機(jī)加入6個(gè)已知序列堿基(用于數(shù)據(jù)分析階段各混樣基因片段的數(shù)據(jù)分離)，擴(kuò)增血清包含NS3蛋白酶抑制劑和NS5A聚合酶抑制劑耐藥位點(diǎn)的基因片段。另在治療失敗患者治療前和復(fù)發(fā)時(shí)取血，擴(kuò)增血清HCV的主要功能區(qū)域(Core、E1、E2、NS2、NS3、NS4、NS5A和NS5B)的部分基因(因二代測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，設(shè)計(jì)每個(gè)片段擴(kuò)增長(zhǎng)度均小于500 bp，具體引物序列可向通訊作者索取)。使用巢式PCR和PrimeStar高保真酶(Takara，大連)擴(kuò)增HCV各基因片段，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen，德國(guó))膠回收試劑盒行PCR產(chǎn)物回收，使用Nanodrop2000核酸定量?jī)x進(jìn)行核酸定量。取每個(gè)樣本DNA 20 ng進(jìn)行混樣，統(tǒng)一進(jìn)行DNA文庫(kù)的構(gòu)建，在數(shù)據(jù)分析階段進(jìn)行數(shù)據(jù)分離。對(duì)上述混樣的DNA基因產(chǎn)物，使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美國(guó))行DNA文庫(kù)的構(gòu)建。對(duì)已構(gòu)建的DNA文庫(kù)送北京諾禾致源公司測(cè)序(Hiseq平臺(tái)，PE250模式)。對(duì)二代測(cè)序錯(cuò)誤率的估計(jì)：本研究在耐藥變異的二代測(cè)序過程中，由于存在HCV RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR和測(cè)序等實(shí)驗(yàn)過程，均可引物堿基錯(cuò)誤，故設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估整個(gè)體系中引入的錯(cuò)誤率。根據(jù)我們課題組前期研究設(shè)立的質(zhì)粒檢測(cè)過程中引物的堿基錯(cuò)誤率和文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，定義1%以上的變異為陽(yáng)性。ASV和DCV耐藥相關(guān)變異的定義：參考文獻(xiàn)[8-10]，ASV相關(guān)耐藥變異(NS3)為：V36L、Q80K、S122N/R/T、D168A/H；DCV耐藥相關(guān)變異(NS5A)為：L31M/F/V和Y93C/H/N。二代測(cè)序數(shù)據(jù)的處理：應(yīng)用FASTX-Toolkits軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，剔除Q30小于90%的序列。應(yīng)用Flash v1.2.7軟件進(jìn)行序列的拼接。然后，應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)一步過濾與分析，剔除大于或小于預(yù)期片段長(zhǎng)度的序列。應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件，并以1%陽(yáng)性截?cái)帱c(diǎn)確定ASV和DCV耐藥變異。應(yīng)用香農(nóng)熵指數(shù)(Sn)描述HCV準(zhǔn)種多復(fù)雜度。使用遺傳距離(d)、非同義突變率(dN)和同義突變率(dS)三個(gè)參數(shù)描述多樣性[11,12]，并應(yīng)用Tajima中性檢驗(yàn)對(duì)治療前和復(fù)發(fā)樣本核酸分子進(jìn)化特征分析。應(yīng)用R語(yǔ)言Vegan包計(jì)算Sn，應(yīng)用Mega7.0軟件計(jì)算d、dN、dS和Tajima中性檢驗(yàn)。最后，應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件對(duì)復(fù)發(fā)樣本核酸序列與治療前核酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算其同源性。

2.3 復(fù)發(fā)患者耐藥變異和病毒準(zhǔn)種變化特征分析 1例治療失敗的CHC患者為49歲男性，有輸血和接受性服務(wù)史，基線血清HCV RNA為1.08×107IU/ml, ALT為74 U/L，B超未提示異常，肝臟硬度為5.9 Kpa，經(jīng)ASV聯(lián)合DCV治療24 w，血清HCV RNA陰性，ALT為39 U/L，停藥12周時(shí)血清HCV RNA為3.58×105IU/ml，ALT為76U/L。對(duì)基線和復(fù)發(fā)時(shí)血清核酸序列進(jìn)行同源性檢測(cè)，結(jié)果提示復(fù)發(fā)與基線血清各基因片段一致性序列為19.9%～45.2%之間，排除重新感染，考慮為復(fù)發(fā)(表2)。

2 結(jié)果

同源性計(jì)算方法為復(fù)發(fā)血清HCV核酸序列與基線血清核酸序列的多序列比對(duì)，一致性的序列定義為同源性序列2.4 基線與復(fù)發(fā)血清病毒耐藥變異和準(zhǔn)種變化特征分析 我們對(duì)上述1例CHC患者基線和復(fù)發(fā)時(shí)病毒NS3蛋白酶抑制劑和NS5A抑制劑相關(guān)耐藥變異進(jìn)行了分析，結(jié)果提示在基線和復(fù)發(fā)時(shí)血清中，均未發(fā)現(xiàn)NS3蛋白酶抑制劑相關(guān)的耐藥變異，但在基線時(shí)，存在L31V+Y93H的NS5A聚合酶抑制劑相關(guān)耐藥變異，耐藥變異頻率分別為2.1%和56.2%，復(fù)發(fā)時(shí)也存在L31V+Y93H耐藥變異，但變異頻率均為100.0%。對(duì)HCV各基因片段準(zhǔn)種多樣性和復(fù)雜度的差異比較，結(jié)果提示在HCV基因組的主要區(qū)域基線準(zhǔn)種復(fù)雜度均顯著高于復(fù)發(fā)時(shí)血清。另外，我們對(duì)基線和復(fù)發(fā)時(shí)血清各HCV基因片段進(jìn)行Tajima中性檢驗(yàn)，結(jié)果提示基線各HCV基因片段序列的D值顯著高于復(fù)發(fā)時(shí)(表3)。

《史記·太史公自序》明確說“太史公(司馬談)仕于建元、元封之間”，即司馬談為官的時(shí)間是在“建元”至“元封”之間?！敖ㄔ?、“元封”均為漢武帝時(shí)年號(hào)，其間包括“元光”、“元朔”、“元狩”、“元鼎”等年號(hào)，時(shí)間跨度從公元前140年至前105年?！敖ㄔ惫灿辛辏劣谒抉R談為官始于“建元”哪一年，司馬遷雖然沒有明載，但上限可確定為“建元元年”至“建元六年”，即前140—前135年的六年之間。

表1 引物序列

HCV NS3基因擴(kuò)增的位置為：nt3518～3929；HCV NS5A擴(kuò)增的位置為：nt 6349～6602，核酸位置基于HCV參考序列H77，NC-004102

厚靶通常是指靶板的厚度大大超過碰撞產(chǎn)生的坑深。小行星撞擊地球形成隕石坑就是典型的超高速?gòu)椡鑼?duì)厚靶(半無(wú)限厚靶)的侵徹現(xiàn)象，如圖1所示。

2.2 ASV聯(lián)合DCV治療的臨床療效和安全性 在本組40例患者中，38例(95.0%)在隨訪12周時(shí)獲得SVR，2例(5.0%)未獲得SVR；92.6%(25/27)CHC患者獲得SVR，100.0%(13/13)代償期丙型肝炎肝硬化均獲得SVR；93.3%(14/15)α-干擾素經(jīng)治和96.0%(24/25)初治的患者獲得SVR。治療失敗的2例患者均存在NS5A抑制劑相關(guān)的耐藥變異，其中1例為L(zhǎng)31V+Y93H變異，另一例為Y93H耐藥變異。在治療過程中，有7例(17.5%)患者出現(xiàn)不良事件，其中2例(5.0%)血清ALT升高，2例(5.0%)出現(xiàn)血小板下降，1例(2.5%)血紅蛋白下降，2例(5.0%)血尿酸升高。上述不良事件均在治療過程中或治療結(jié)束后恢復(fù)正常，未導(dǎo)致患者停藥。

表2 1例復(fù)發(fā)患者基線與復(fù)發(fā)時(shí)血清HCV基因片段同源序列分析

2.1 一般資料 在本組40例患者中，男性23例，女性17例；中位年齡為39(28，53)歲；病毒載量為6.3±0.8 lgIU/ml；15例(37.5%)為α-干擾素經(jīng)治患者；10例(25.0%)患者基線谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平大于正常值上限；1例(2.5%)存在NS3蛋白酶抑制劑(ASV)相關(guān)的D168E基線耐藥變異，1例(2.5%)存在NS5A聚合酶抑制劑(DCV)相關(guān)的L31M耐藥變異，1例(2.5%)存在L31V/Y93H耐藥變異，另2例(5.0%)存在Y93H耐藥變異。

表3 基線與復(fù)發(fā)時(shí)血清HCV基因片段準(zhǔn)種復(fù)雜度、多樣性和Tajima中性檢驗(yàn)差異比較

Sn、d、dN和dS的單位均為10-3變異/位點(diǎn)，基線血清HCV準(zhǔn)種復(fù)雜度(Sn)、多樣性(d、dN和dS)和Tajima中性檢驗(yàn)的D值(配對(duì)t檢驗(yàn))均顯著高于復(fù)發(fā)血清(P<0.05)

3 討論

ASV聯(lián)合DCV方案是在2017年在中國(guó)獲批準(zhǔn)上市，是國(guó)內(nèi)首個(gè)上市的DAA藥物，主要適用于HCV 1b基因型感染的CHC患者[4, 13]，該方案在上市前的臨床試驗(yàn)和真實(shí)世界的研究均顯示出良好的療效和安全性[1,2,14]。

相比器官移植醫(yī)學(xué)實(shí)踐，我國(guó)器官移植立法起步較晚。2003年《深圳經(jīng)濟(jì)特區(qū)器官捐獻(xiàn)移植條例》頒布，這是我國(guó)首部器官移植地方性法規(guī)。2006年衛(wèi)生部制定《人體器官移植技術(shù)臨床應(yīng)用管理暫行規(guī)定》，2007年國(guó)務(wù)院通過《人體器官移植條例》，“任何組織或者個(gè)人不得以任何形式買賣人體器官，不得從事與買賣人體器官有關(guān)的活動(dòng)”。關(guān)于器官移植可能承擔(dān)的法律責(zé)任，除規(guī)定行政和民事責(zé)任外，還指出，違反本條例規(guī)定，有下列情形之一，構(gòu)成犯罪的，依法追究刑事責(zé)任:未經(jīng)公民本人同意摘取其活體器官的;公民生前表示不同意捐獻(xiàn)其人體器官而摘取其尸體器官的;摘取未滿18周歲公民的活體器官的。

本研究在小樣本的短期觀察發(fā)現(xiàn)該方案治療CHC和丙型肝炎肝硬化患者療效好，只有少數(shù)患者治療失敗，可能與存在DCV相關(guān)的L31V+Y93H耐藥變異或Y93H耐藥變異有關(guān)，提示存在基線NS5A抑制劑相關(guān)耐藥變異者應(yīng)避免選擇ASV聯(lián)合DCV治療方案。

準(zhǔn)種分析提示復(fù)發(fā)血清各HCV基因片段的準(zhǔn)種復(fù)雜度和多樣性顯著低于基線血清，而Tajima中性檢驗(yàn)提示復(fù)發(fā)血清D值顯著小于0并小于基線血清，提示ASV聯(lián)合DCV治療方案對(duì)該例病情復(fù)發(fā)患者體內(nèi)存在的L31V+Y93H耐藥變異毒株敏感性差，有關(guān)研究還需擴(kuò)大進(jìn)行。