豬鏈球菌2型臨床分離株的分離鑒定和生物學(xué)特性分析

夏 葉，鄭琳琳，李春華，郭佳宏，凌紅麗，蔣貽海，繆德年*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106；3青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島 266001)

豬鏈球菌病(swine streptococcosis)是一種重要的人畜共患傳染病，會(huì)引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、流產(chǎn)及仔豬突然死亡等[1]，人通過(guò)接觸污染的生肉產(chǎn)品或患病動(dòng)物而引發(fā)感染，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生中毒性休克甚至死亡[2]。該病不僅危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，也對(duì)從業(yè)人員的健康造成威脅，危害公共衛(wèi)生安全。豬鏈球菌(Streptococcussuis)是引起豬鏈球菌病的病原菌，該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌分為35個(gè)血清型：1—34型及1/2型。其中豬鏈球菌2型流行最廣、毒力最強(qiáng)，是最易引發(fā)人和動(dòng)物感染的血清型[3-4]。

不同豬鏈球菌菌株之間的致病力存在顯著差異，這種差異可能與菌株的毒力基因分布有關(guān)。豬鏈球菌的主要毒力基因包括谷氨酸脫氫酶gdh(glutamate dehydrogenase)、溶菌酶釋放蛋白mrp(muramidase-released protein)、胞外因子epf(extracellular protein factor)、溶血素sly(suislysin)、莢膜多糖cps(capsular polysaccharide)、毒力相關(guān)序列orf2(virulent-assocciated sequence)以及纖連蛋白原結(jié)合蛋白fbps(fibronectin-binding proteins)[5-6]。不同地區(qū)分離株的毒力基因分布具有差異性。gdh基因存在于所有的豬鏈球菌菌株中，且GDH蛋白在抗原性上具有較好的種屬特異性，可作為檢測(cè)豬鏈球菌的標(biāo)識(shí)[7]。本研究擬通過(guò)PCR和生化方法鑒定分離株及其毒力基因分布，并對(duì)該分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，以期為臨床防治、監(jiān)管和治療豬鏈球菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid有限公司；血平板和革蘭氏染色液購(gòu)自廣東環(huán)凱生物有限公司；細(xì)菌微量發(fā)酵管和藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；2×Taq MasterMix、DNA Marker和DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gold View核酸染料購(gòu)自北京賽百勝生物技術(shù)公司。

1.2 病料來(lái)源

病料組織采集于江蘇某大型規(guī)?；i場(chǎng)中典型發(fā)病仔豬的關(guān)節(jié)液及腦脊液。

1.3 病原菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌采集發(fā)病仔豬的關(guān)節(jié)液和腦脊液，接種至TSA血平板，37℃培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌的培養(yǎng)情況。挑取典型單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12h。將純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，并對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行傳代純化。

1.4 生化試驗(yàn)

將純培養(yǎng)的細(xì)菌接種于微量發(fā)酵管內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察其產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的生化反應(yīng)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

參照Tang等[8]的報(bào)道，合成豬鏈球菌管家基因gdh和重要毒力基因sly、epf、mrp的引物序列，鑒定該分離株是否為豬鏈球菌。參照Smith等[9]的報(bào)道，合成豬鏈球菌1型和2型分型基因cpsI1和cps2J的引物，進(jìn)行分型鑒定。引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 PCR反應(yīng)引物

1.6 基因組DNA的提取

過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)PBS洗滌后離心收集菌體，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA待用。

1.7 管家基因及血清分型鑒定

以上述DNA為模板，進(jìn)行管家基因gdh以及分型基因cpsI1和cps2J的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O補(bǔ)齊至總反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.8 毒力基因檢測(cè)

以上述DNA為模板，進(jìn)行3種主要毒力基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物(10μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至總反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.9 藥敏檢測(cè)

采用藥敏試紙擴(kuò)散法進(jìn)行分離株的藥敏試驗(yàn)。將過(guò)夜培養(yǎng)的分離株液體培養(yǎng)物均勻涂布于TSA血平板，將藥敏試紙貼于血平板上，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏試紙說(shuō)明書對(duì)分離株的藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離

分離菌在血平板上呈現(xiàn)直徑0.1—1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊的圓形小菌落，呈 α 溶血(圖1A)；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌落呈單個(gè)、成對(duì)或短鏈存在(圖1B)，命名為HA21。

2.2 生化試驗(yàn)

該分離株能發(fā)酵果糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖產(chǎn)酸，為陽(yáng)性反應(yīng)；發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯糖不產(chǎn)酸，為陰性反應(yīng)，與豬鏈球菌的生化反應(yīng)結(jié)果相符。

2.3 管家基因及血清分型鑒定

PCR結(jié)果顯示：該分離株管家基因gdh的鑒定結(jié)果為陽(yáng)性(圖2)，確定該分離菌為豬鏈球菌；分型基因cpsI1鑒定結(jié)果為陰性，cps2J鑒定結(jié)果為陽(yáng)性，確定該分離菌為豬鏈球菌2型(圖3)。

2.4 毒力基因分布分析

采用PCR方法檢測(cè)到該分離株主要毒力基因的分布情況為sly+/mrp+/epf+(圖4)。其中，目的片段Sly的條帶大小為248bp，mrp的條帶大小為885bp，epf的條帶大小為442bp，與預(yù)期相符。

2.5 藥敏檢測(cè)結(jié)果

該分離株對(duì)青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢拉定、先鋒霉素、氧氟沙星敏感，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)卡那霉素、壯觀霉素、阿奇霉素、林可霉素、鏈霉素、紅霉素不敏感。

3 討論

豬鏈球菌病是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一。近年來(lái)，豬鏈球菌病多次在國(guó)內(nèi)暴發(fā)，特別是四川、江蘇、廣東等養(yǎng)殖大省[10-11]，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，危害公共衛(wèi)生安全。在35種豬鏈球菌血清型中，1型、1/2型、2型、7型、9型和14型為主要血清型，目前我國(guó)最流行的血清型為豬鏈球菌2型，多次爆發(fā)的疫情均為2型感染[12]。本研究中分離得到的菌株經(jīng)形態(tài)、生化試驗(yàn)和PCR鑒定，確定為豬鏈球菌2型。

Vecht等[13]認(rèn)為，雖然豬鏈球菌存在多種毒力相關(guān)因子，但sly、mrp和epf這3個(gè)毒力基因被認(rèn)為是判定豬鏈球菌2型毒力強(qiáng)弱的指標(biāo)。一般認(rèn)為強(qiáng)毒株的毒力基因分布為mrp+/sly+/epf+，從發(fā)病豬體內(nèi)分離得到的菌株普遍為強(qiáng)毒株；而弱毒株的毒力基因分布為mrp-/sly-/epf-，從健康豬體內(nèi)分離得到的菌株通常為弱毒株。然而，近幾年Gottschalk等[6]從發(fā)病豬體內(nèi)分離得到的多個(gè)豬鏈球菌2型分離株的毒力基因分布表現(xiàn)為mrp-/+/sly-/epf-。Dong等[14]發(fā)現(xiàn)mrp+的分離株也存在低毒力表型，而mrp-也存在高毒力表型。本研究中的豬鏈球菌為從病死豬體內(nèi)分離得到，其毒力基因分布為sly+/mrp+/epf+，推斷該分離株HA21可能為強(qiáng)毒株。

目前，對(duì)豬鏈球菌病的治療和預(yù)防手段主要是抗生素防治。但隨著抗生素的使用越來(lái)越廣泛、劑量越來(lái)越大，菌株的耐藥性也隨之增高，導(dǎo)致利用抗生素防控豬鏈球病的難度越來(lái)越大。本研究通過(guò)對(duì)臨床分離的豬鏈球菌HA21進(jìn)行藥敏分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢拉定等β-內(nèi)酯酰胺類抗生素敏感；對(duì)卡那霉素、鏈霉素、紅霉素等抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生物合成的抗生素耐藥性嚴(yán)重。因此，該豬場(chǎng)對(duì)豬鏈球菌病的用藥應(yīng)以青霉素為主，頭孢類藥物為輔，選擇性的輪換用藥，避免產(chǎn)生抗生素耐受。定期的藥敏檢測(cè)可避免飼養(yǎng)過(guò)程中的抗生素濫用，指導(dǎo)發(fā)病時(shí)的臨床用藥，并防止耐藥菌株甚至超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生。由于豬體的耐藥基因可通過(guò)接觸或食物鏈等方式傳遞給人類，因此對(duì)菌株的耐藥性監(jiān)測(cè)不僅對(duì)豬場(chǎng)的疾病防治具有指導(dǎo)作用，對(duì)人類及公共衛(wèi)生安全也有重大意義。